脈沖電磁場(chǎng)對(duì)模擬高原環(huán)境下大鼠骨折愈合的影響

柏 鑫，樊 佳，侯雪峰，高玉海，吳思敏，任 莉，陳克明

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)修復(fù)過程，骨折愈合程度和時(shí)間受年齡、基礎(chǔ)疾病、受傷程度、骨折部位、骨折類型及治療方法等因素影響[1]，常需手術(shù)治療，且延遲愈合、骨不連是術(shù)后常見并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，高原地區(qū)骨折愈合時(shí)間較平原地區(qū)延長(zhǎng)，且骨折延遲愈合、骨不連發(fā)生率高于平原地區(qū)[2]，原因可能與高原地區(qū)氧分壓低致缺氧、大氣壓低、氣候干燥寒冷等多種因素對(duì)骨折愈合產(chǎn)生負(fù)面影響有關(guān)[3]。1974年Basset首次應(yīng)用脈沖電磁場(chǎng)(PEMFs)治療骨不連取得較滿意效果[4]，PEMFs以無創(chuàng)傷、無接觸、安全性高、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床新鮮舟骨骨折、脛骨骨折延遲愈合等的治療[5]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，采用股骨橫斷骨折加克氏針?biāo)鑳?nèi)固定法建立動(dòng)物模型，通過觀察動(dòng)物生活習(xí)性、影像學(xué)、生物力學(xué)等評(píng)判電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)高原環(huán)境下骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑公司，中國(guó))、注射用青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó))、碘伏皮膚消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，中國(guó))、0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，中國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 電磁場(chǎng)治療儀(本實(shí)驗(yàn)室自行研制，專利號(hào)：ZL201120528586.0)，DYC-3070型模擬高原低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙群(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)，AG-X系列臺(tái)式電子萬能試驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本)，High Resolutionin-vivo X-ray Microtomograph(布魯克科技有限公司，德國(guó))，X線照片機(jī)(HOLOGIC公司，美國(guó))，-20℃低溫冰箱(三洋公司，日本)，1.2 mm鈦合金克氏針(張家港市華陽醫(yī)療器械廠，中國(guó))，骨科鉆(上海紫靄醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))，可吸收縫合線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司，中國(guó))；圓鋸，彎剪若干，手術(shù)刀，止血鉗若干，3-0可吸收縫合線等相關(guān)手術(shù)器械。

1.3動(dòng)物分組與處理 36只6～8周齡、體質(zhì)量(220±10)g的雄性Wistar大鼠，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(甘)2018-0002。36只大鼠在本院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為平原對(duì)照組、高原對(duì)照組、高原電磁場(chǎng)治療組，每組12只。

1.4造模方法 將大鼠禁食24 h后經(jīng)10%水合氯醛(0．3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠右下肢剃毛，局部皮膚碘伏消毒，鋪無菌洞巾。沿右側(cè)股骨切開皮膚，鈍性分離肌肉并充分暴露股骨，使用直徑0.8 mm克氏針垂直于股骨平行鉆孔，間距約1 cm，使用圓鋸垂直鋸斷股骨，切割同時(shí)使用生理鹽水沖洗，防止過熱損傷相應(yīng)組織，將可吸收縫合線依次穿過斷端0.8 mm孔洞備用，使用1.2 mm克氏針固定股骨，確認(rèn)固定牢靠后將可吸收縫合線打結(jié)，保證骨折斷端穩(wěn)定性。逐層縫合傷口，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后行X線檢查，確認(rèn)骨折類型為股骨中段橫斷骨折或短斜形骨折，骨折斷裂間隙≤0.5 mm，骨折對(duì)位良好、無移位，即為造模成功[6]。

1.5干預(yù)措施 等待大鼠麻醉蘇醒后將高原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組大鼠分別放入低壓氧艙，以20 m/min的速度上升至海拔5000 m高度[7]，平原對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)于本院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(海拔1400 m)，高原電磁場(chǎng)治療組大鼠采用50 Hz、0.6 mT、50%占空比的PEMFs處理，90 min/d[8]，其余2組大鼠做相同處理，但設(shè)備不通電。共干預(yù)8周，干預(yù)期間大鼠自由進(jìn)食、攝水。

1.6觀察項(xiàng)目與方法

1.6.1動(dòng)物生活習(xí)性、體質(zhì)量及臟器系數(shù)：實(shí)驗(yàn)期間密切觀察大鼠生理反應(yīng)和生活習(xí)性的變化，注意皮毛色澤、手術(shù)傷口是否發(fā)生感染、可吸收縫合線是否脫落及是否出現(xiàn)健肢代償。每2周稱量大鼠體質(zhì)量1次，開始實(shí)驗(yàn)8周后采取頸椎脫臼法處死大鼠，立即取出心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟并稱重，計(jì)算各臟器與體質(zhì)量的比值即為臟器系數(shù)[9]。

1.6.2X線骨痂評(píng)分：每2周對(duì)大鼠行X線檢查，掃描時(shí)先麻醉大鼠，后俯臥位拍攝每只大鼠。通過X線片觀察各組大鼠骨痂生長(zhǎng)情況，并根據(jù)X線骨痂評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)請(qǐng)2名骨科醫(yī)師及1名影像學(xué)醫(yī)師評(píng)定大鼠骨痂生長(zhǎng)情況。骨折斷端未見骨痂為Ⅰ級(jí)；骨折斷端邊緣模糊，少見骨痂為Ⅱ級(jí)；斷端邊緣進(jìn)一步模糊，骨痂量增多但尚未填滿骨折缺損部位為Ⅲ級(jí)；斷端邊緣已完全消失，骨折缺損部位被骨痂填滿為Ⅳ級(jí)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)分別記為0、1、2、3分。

1.6.3生物力學(xué)指標(biāo)：開始實(shí)驗(yàn)8周后，各組隨機(jī)取6只大鼠，頸椎脫臼法處死，迅速分離術(shù)側(cè)股骨，剔除軟組織，拔出髓內(nèi)釘，迅速用生理鹽水浸泡紗布包裹保存于-20℃冰箱中待用，檢測(cè)時(shí)樣本室溫下自然晾干后置于AG-IS生物力學(xué)萬能試驗(yàn)機(jī)上行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距17 mm，中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，加載速度為2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，得出彈性模量和最大載荷骨生物力學(xué)指標(biāo)值[10]。

1.6.4顯微CT掃描結(jié)果：開始實(shí)驗(yàn)4、8周后隨機(jī)從各組取3只大鼠，過量麻醉處死，取出術(shù)側(cè)股骨，剔除軟組織，拔出髓內(nèi)釘后用4%多聚甲醛固定后室溫保存。使用SkyScan1276顯微CT掃描儀，源電壓85 V，源電流200 μA，中度分辨率，感興趣區(qū)域?yàn)橐怨钦劬€為中心的前后4 mm區(qū)域。使用CTvox軟件對(duì)股骨建模，使用NRecon軟件進(jìn)行三維重建。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)期間3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。開始實(shí)驗(yàn)8周后3組大鼠臟器系數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飲食飲水無明顯變化，皮毛色澤正常、手術(shù)傷口無感染、縫合線自然脫落，未出現(xiàn)健肢代償，飼養(yǎng)于模擬高原環(huán)境下大鼠活動(dòng)稍減弱。

表1 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化情況

表2 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)8周后臟器系數(shù)比較情況

2.2X線骨痂評(píng)分及X線檢查結(jié)果比較 實(shí)驗(yàn)期間，平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組骨折X線骨痂評(píng)分均高于高原對(duì)照組(P<0．05)，平原對(duì)照組與高原電磁場(chǎng)治療組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間X線骨痂評(píng)分情況分)

造模后及開始實(shí)驗(yàn)2、4、6、8周后3組大鼠股骨X線檢查情況見圖1。開始實(shí)驗(yàn)2周后3組均有骨痂形成，但高原對(duì)照組骨痂量相對(duì)較少。開始實(shí)驗(yàn)4周后平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組骨折周圍可見梭形骨痂影，骨折線模糊，而高原對(duì)照組雖有骨痂形成但骨折線仍清晰可見。開始實(shí)驗(yàn)6周后平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組骨折周圍梭形影逐漸規(guī)則、致密，而高原對(duì)照組仍可見模糊骨折線。開始實(shí)驗(yàn)8周后平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組股骨應(yīng)力軸線以外的骨痂較前減少，說明此時(shí)骨折已進(jìn)入骨痂塑形期，而高原對(duì)照組骨折斷端仍有不規(guī)則骨痂，由此可見高原對(duì)照組骨折愈合較其他2組緩慢。

2.3生物力學(xué)指標(biāo)比較 開始實(shí)驗(yàn)8周后，高原對(duì)照組股骨彈性模量、最大載荷均低于平原對(duì)照組與高原電磁場(chǎng)治療組(P<0．05)，平原對(duì)照組與高原電磁場(chǎng)治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組大鼠實(shí)驗(yàn)8周后股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較

2.4顯微CT掃描結(jié)果比較 開始實(shí)驗(yàn)4周后顯微CT掃描感興趣區(qū)骨痂平面橫切圖(圖2)、立體重建圖(圖3)及立體縱切圖(圖4)可見，平原對(duì)照組與高原電磁場(chǎng)治療組骨折斷端出現(xiàn)大量骨痂包裹，骨折斷端邊緣模糊，缺損區(qū)域幾乎被骨痂填滿。高原對(duì)照組骨折斷端生成的骨痂較少，骨折斷端邊緣仍清晰可見，缺損區(qū)域較大且僅有少量骨痂填充。開始實(shí)驗(yàn)8周后顯微CT掃描感興趣區(qū)骨痂平面橫切圖(圖5)、立體重建圖(圖6)及立體縱切圖(圖7)可見平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組股骨應(yīng)力軸線以外的骨痂較開始實(shí)驗(yàn)4周后減少，骨小梁排列規(guī)則、致密，骨折部位形成骨性連接，而高原對(duì)照組骨折周圍仍可見梭形骨痂，骨折線仍可見。進(jìn)一步證明高原對(duì)照組骨折愈合較其他2組緩慢。

圖2 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)4周后顯微CT掃描平面橫切圖

圖3 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)4周后顯微CT掃描立體重建圖

圖4 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)4周后顯微CT掃描立體縱切圖

圖5 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)8周后顯微CT掃描平面橫切圖

圖6 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)8周后顯微CT掃描立體重建圖

圖7 3組大鼠開始實(shí)驗(yàn)8周后顯微CT掃描立體縱切圖

3 討論

骨折是臨床骨科常見疾病，骨折延遲愈合、不愈合是骨折術(shù)后常見并發(fā)癥，而在高海拔、低氣壓、低氧、低溫環(huán)境下骨延遲愈合、骨不連的發(fā)生率均高于平原地區(qū)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來隨著高原醫(yī)學(xué)的發(fā)展，高原低壓缺氧環(huán)境對(duì)骨組織的影響逐漸受到人們的關(guān)注[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠一般情況、測(cè)量體質(zhì)量及計(jì)算臟器系數(shù)來比較不同飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)大鼠身體狀況的影響，結(jié)果顯示整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中飼養(yǎng)于模擬高原環(huán)境下大鼠活動(dòng)稍減弱，3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臟器系數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3組大鼠一般情況良好，精神狀態(tài)佳，提示本實(shí)驗(yàn)所用電磁場(chǎng)設(shè)備具有較好的安全性。通過X線骨痂評(píng)分及圖像比較骨痂生長(zhǎng)情況及骨折愈合情況。X線骨痂評(píng)分結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)期間平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組X線骨痂評(píng)分均高于高原對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而平原對(duì)照組與高原電磁場(chǎng)治療組X線骨痂評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。X線圖像比對(duì)顯示，實(shí)驗(yàn)期間平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組愈合情況較接近，而高原對(duì)照組骨痂形成緩慢且數(shù)量相對(duì)較少，骨折愈合較其他2組緩慢，同時(shí)顯微CT掃描結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。通過股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)來檢測(cè)骨生物力學(xué)性能，骨生物力學(xué)參數(shù)可以直接反映出骨的抗骨折能力，骨最大載荷可以客觀反映出骨整體的抗骨折能力，彈性模量可客觀反映骨自身的相對(duì)韌性[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，開始實(shí)驗(yàn)8周后平原對(duì)照組及高原電磁場(chǎng)治療組彈性模量及最大載荷均高于高原對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而平原對(duì)照組與高原電磁場(chǎng)治療組彈性模量及最大載荷比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示電磁場(chǎng)治療提高了高原環(huán)境下骨折骨組織的生物力學(xué)性能，使高原環(huán)境下骨折骨組織的生物力學(xué)性能與平原低海拔地區(qū)相近。

綜上，PEMFs干預(yù)可以有效加速模擬高原環(huán)境下股骨骨折大鼠骨折愈合，促進(jìn)骨痂形成，縮短骨折愈合時(shí)間，提高股骨強(qiáng)度,使骨折愈合情況與平原低海拔地區(qū)相近，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。