基于影像學評價正弦電磁場對大鼠股骨骨折的影響

侯雪峰，賈鵬舉，柏 鑫，高玉海，任 莉，吳思敏，陳克明

骨折是人類最常見的大器官創傷[1]，其愈合時間久，常給患者帶來巨大的痛苦，因此如何促進骨折愈合成為目前研究的熱點。隨著物理學與生物學及醫學的相互交叉結合，電磁場物理療法在骨質疏松癥及其他代謝性骨疾病治療中的應用越來越廣泛。研究表明，正弦電磁場(SEMFs)在特定條件參數下對胎兒成骨細胞及主動脈血管平滑肌細胞等多種細胞的增殖具有促進作用[2]。相關研究指出，暴露持續時間90 min是SEMFs發揮作用的最佳時間[3]。本課題組前期研究也顯示，50 Hz的1.8 mT電磁場以波形依賴的方式影響成骨細胞的增殖和分化[4]；50 Hz的1.8 mT正弦交變電磁場可通過提高骨形成降低具有骨吸收活性的相關細胞因子的表達，有效提高青年大鼠的峰值骨量,并有效抑制尾吊大鼠的骨量丟失[5-7]；50 Hz、1.8 mT的SEMFs能提高大鼠股骨組織中骨代謝相關基因的表達，同時增加鈣含量[8]。目前關于SEMFs的研究多集中于骨質疏松癥，對于SEMFs促進骨折愈合的研究尚不多見。因此結合本課題組的前期研究，本實驗主要研究治療時間為90 min的50 Hz、1.8 mT SEMFs對大鼠股骨骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1實驗儀器與器械 電磁場治療儀，病理切片掃描儀(濱松公司，日本)，AG-X系列臺式電子萬能試驗機(島津公司，日本)，High Resolutionin-vivo X-ray Microtomograph(布魯克科技有限公司，德國)，X線照片機(HOLOGIC公司，美國)，鈦合金克氏針(張家港市華陽醫療器械廠，中國)，骨科鉆(上海紫靄醫療器械有限公司，中國)，可吸收縫合線(上海浦東金環醫療用品股份有限公司，中國)，圓鋸，手術器械。

1.2實驗試劑 水合氯醛(天津大茂化學試劑公司，中國)、注射用青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司，中國)、碘伏皮膚消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，中國)、75%乙醇(山東利爾康醫療科技股份有限公司，中國)、0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司，中國)。

1.3實驗動物及處理方法 SPF級Wistar雄性大鼠40只，體質量(220±10)g，由蘭州大學中國農業科學研究院獸醫研究所實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK(甘)2014-0006-152。40只大鼠飼養于解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院SPF級動物實驗中心，許可證編號：SYXK(軍)2017-0047，適應性馴化1周后建立大鼠股骨開放性骨折模型。建模完成后立即攝X線片，確定大鼠建模是否成功，將建模成功大鼠隨機分成模型對照組(MC組)和SEMFs治療組(SEMFs組)，每組20只，嚴格控制溫度、濕度，自由進食水。MC組不采取任何干預措施，SEMFs組每天給予50 Hz、1.8 mT SEMFs干預90 min。

1.4檢測項目與方法

1.4.1主要臟器HE染色及器官指數：開始實驗8周后脫頸處死大鼠，迅速取出肝、腎、脾、心、肺，將周圍脂肪及黏膜組織剝離干凈，生理鹽水清洗殘留血液，反復清洗3遍后用濾紙吸干多余的生理鹽水并稱取各器官重量，計算器官指數。器官指數=器官重量/大鼠體質量×100%。

1.4.2X線檢查：每2周對大鼠行X線檢查，每次檢查時先麻醉大鼠，然后對每只大鼠進行檢查，檢查體位為俯臥位。通過X線片觀察各組大鼠骨痂生長情況，并根據骨痂評分標準對大鼠骨痂生長情況進行評分。骨痂評分標準：斷端未見骨痂為Ⅰ級；斷端邊緣模糊，少見骨痂為Ⅱ級；斷端邊緣進一步模糊，骨痂量增多但尚未填滿骨折缺損部位為Ⅲ級；斷端邊緣已完全消失，骨折缺損部位被骨痂填滿為Ⅳ級。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級分別記為0、1、2、3分。

1.4.3生物力學指標檢測：開始實驗8周后，隨機取2組大鼠各6只，過量麻醉處死大鼠，迅速分離術側股骨，剔除股骨周圍其他組織，用生理鹽水浸泡過的紗布包裹于-20℃冰箱中保存。后將凍存的股骨室溫解凍2 h置于AG-IS生物力學萬能試驗機上行三點彎曲試驗，支點跨距17 mm，中點為加壓點，加載速度為2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，得出彈性模量、最大載荷和斷裂點載荷骨生物力學指標值。

1.4.4顯微CT三維重建：分別于各組開始實驗4、8周后隨機取3只大鼠，過量麻醉處死，取出術側股骨，4%多聚甲醛固定后室溫保存。采用SkyScan1276掃描儀，源電壓85 V，源電流200 μA，中度分辨率，感興趣區域為以骨折線為中心的前后4 mm區域。使用CTvox軟件對股骨建模，使用NRecon軟件進行三維重建。

1.4.5骨組織病理學檢測：開始實驗4周后，脫頸處死2組大鼠，迅速取出術側股骨固定于4%多聚甲醛溶液中，1周后進行包埋、切片、染色處理，處理后使用病理切片掃描儀進行掃描，生成圖像后使用NDP.veiw軟件進行觀察。

2 結果

2.1SEMFs安全性分析 開始實驗8周后，2組大鼠主要臟器的器官指數比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1；開始實驗8周后，2組大鼠主要器官的組織病理學表現也未見明顯異常改變，見圖2。提示長期給予50 Hz、1.8 mT SEMFs治療對生長期大鼠未產生明顯的毒副作用。

圖1 開始實驗8周后股骨骨折2組大鼠主要臟器器官指數

圖2 開始實驗8周后股骨骨折2組大鼠主要臟器的組織病理學檢查結果(HE染色)

2.22組大鼠X線檢查結果比較 X線檢查結果顯示，SEMFs組股骨骨痂生長速度及質量均明顯優于MC組。開始實驗4周后，SEMFs組骨折線幾乎消失，骨痂大量生長形成骨橋連結，骨痂基本填滿骨折缺損部位；開始實驗6周后，可見骨痂進一步鈣化，并且開始骨痂塑形；開始實驗8周后骨痂塑形基本完成。MC組開始實驗4周及6周后仍然可見明顯的骨折縫隙，縫隙中骨痂含量較少，至開始實驗8周后觀察僅有一半的骨橋連結相對完整，另一半骨折線仍清晰可見。見圖3。骨痂評分結果顯示，SEMFs組各階段骨痂評分均高于MC組(P<0.01)，見圖4。

圖3 股骨骨折2組大鼠X線檢查骨折愈合情況

圖4 股骨骨折2組大鼠X線骨痂評分比較

2.32組大鼠股骨生物力學指標檢測結果比較 開始實驗8周后2組大鼠股骨三點彎曲試驗結果顯示，SEMFs組彈性模量顯著升高(P<0.01)，而2組最大載荷與斷裂點載荷比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。提示SEMFs可增強骨折愈合后股骨的韌性。

表1 股骨骨折2組大鼠實驗8周三點彎曲試驗結果

2.42組大鼠顯微CT結果比較 顯微CT掃描結果顯示，開始實驗4周后SEMFs組骨折斷端部位骨痂填充良好，骨橋連結完整，而MC組骨折斷端部位骨痂填充較少，骨橋尚未連接。開始實驗8周后，SEMFs組明顯可見骨痂塑形基本結束，股骨形態基本恢復，而MC組骨痂尚未完全吸收，見圖5、6。顯微CT三維立體重建結果顯示，SEMFs組骨痂生長塑形進程明顯快于MC組，開始實驗8周后SEMFs組股骨表面較MC組平整，基本恢復股骨原有形態，見圖7。

圖5 股骨骨折2組大鼠股骨顯微CT平面橫切圖

圖6 股骨骨折2組大鼠股骨顯微CT立體橫切圖

圖7 股骨骨折2組大鼠股骨顯微CT三維立體重建圖

2.52組大鼠股骨組織病理學觀察 開始實驗4周后，SEMFs組骨痂組織中見大量成熟的骨組織，排列相對整齊，而MC組骨折斷端主要以纖維軟骨細胞為主，鈣化不明顯。見圖8。提示SEMFs在促進骨折愈合方面具有良好效果，且無明顯毒副作用。

圖8 股骨骨折2組大鼠股骨組織病理學檢查結果(HE染色)

3 討論

骨折常由于跌撲撞擊等外力作用導致，常通過手術解剖復位，但其修復時間漫長，且術后常有骨延遲愈合及骨不連的發生，發生率為8%～10%[9]。如何促進骨折修復，縮短病程，減輕患者痛苦成為創傷骨科的一大難題。

近年來，物理療法因便捷有效逐漸成為醫療研究的熱點。相關研究表明，電磁場作為一種可調節的恒強磁場對體內的細胞、基因、蛋白可產生多種影響[10]。本課題組前期研究證實1.8 mT的SEMFs可促進體外培養大鼠股骨組織的骨形成，提高骨組織中堿性磷酸酶活性，并抑制骨吸收，調節骨骼重塑[11]。同時本課題組研究發現，50 Hz的SEMFs具有雙強度窗效應，即在1.8 mT和3.6 mT作用下最為明顯[12-13];進一步研究證實，治療時間為1.5 h的1.8 mT、50 Hz的SEMFs可促進體外培養成骨細胞的成熟及礦化[14]。除此之外，SEMFs對骨髓間充質干細胞的分化成熟也有一定影響，SEMFs以時間依賴性的方式誘導骨髓間充質干細胞成骨性分化，且以1.8 mT強度干預效果最為明顯[15-17]。SEMFs發揮作用主要是通過激活Wnt10b/β-catenin、BMP-Smad及NO-cGMP-PKG等多條信號途徑促進成骨細胞的分化成熟與礦化，同時通過調節成骨細胞前列腺素E2分泌影響OPG/Rankl的基因表達，進而抑制破骨細胞的骨吸收活性[18-22]。

本動物實驗表明，SEMFs組X線骨痂評分明顯優于MC組，且通過不同時間的X線觀察可以確定SEMFs組骨折愈合速度明顯加快，顯微CT結果進一步表明SEMFs組的骨折修復效果優于MC組。SEMFs組骨痂組織中可見大量成熟的骨組織，排列相對整齊，而MC組骨折斷端主要以纖維軟骨細胞為主，鈣化不明顯，說明SEMFs在促進骨折愈合方面具有良好效果，且無明顯的毒副作用。另外，在本實驗結果中，生物力學指標未表現出明顯的差異性，開始實驗8周后，SEMFs組骨折塑形基本完成，而MC組尚有大量骨痂存在，可能為最大載荷及斷裂點載荷未表現出差異性的原因。

綜上，SEMFs對骨折愈合具有良好的促進作用，可明顯促進骨痂生長，改善骨組織形態學，促進大鼠股骨骨折的愈合。本研究僅初步證明了SEMFs對骨折愈合具有一定的作用，雖然本課題組前期的體外研究已經闡明了一些作用機制，但是由于機體相對于組織細胞更系統、更復雜，故其具體作用機制仍需在體實驗進一步揭示驗證。