膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達及與臨床病理特征和預后的關系

徐順林，格桑志瑪，土登·降擁尼瑪，賈禮華

膽囊癌是目前臨床較為罕見的一種高致死性惡性腫瘤性疾病[1]。2018年，根據國際癌癥研究機構數據庫數據分析顯示，膽囊癌占所有癌癥相關死亡的1.7%[2]。根據報道，在世界范圍內，膽囊癌對女性的影響較男性大，此外膽囊癌的發生率隨著人們年齡的增長而逐漸升高，有2/3的膽囊癌患者年齡超過了65歲[3]。根據美國癌癥協會稱，僅有約1/5的膽囊癌患者在腫瘤未轉移前被發現，這極大限制了治療方法的選擇，并且顯著縮短了患者的生存時間[4]?；瘜W療法和放射療法對膽囊癌的作用不大，根治性手術仍然是目前本病最為有效的治療方法。但是因為膽囊癌患者初期常常無癥狀及其快速轉移的特點，使得大多數膽囊癌患者診斷時已處于晚期，只有不到20%的患者符合手術切除條件，導致該病預后大多不良[5]。因此，發現新的潛在生物學標志物用于預后評估和深入闡明癌癥進展的分子機制，對于更好地治療膽囊癌具有一定的價值。MicroRNA(miRNA)是非編碼、進化保守的單鏈RNA，它們附著在其靶基因的3'-非翻譯區(3'-UTR)的互補結合位點上，并且通過轉錄后基因調控發揮著各種生物學功能[6]。最近許多miRNA已證明可作為癌癥有效的生物學標志物或功能性調節劑[7]。故本研究擬通過對膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143水平進行分析，探討其與膽囊癌患者臨床病理特征和預后的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月—2017年6月就診的膽囊癌患者86例作為疾病組，同期體檢健康志愿者40例作為對照組。疾病組中男33例，女53例；年齡52～75(64.28±5.47)歲；分化程度：低分化39例，中分化25例，高分化22例；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期20例，Ⅲ期36例，Ⅳ期17例；淋巴結轉移29例。對照組中男14例，女26例；年齡50～75(62.15±4.85)歲。

1.2納入與排除標準 納入標準：依據第八版《外科學》[8]中相關診斷標準初診為膽囊癌；經術后病理學檢查確診；簽署本研究知情同意書；采用膽囊切除加區域淋巴結清掃術，且未接受術后輔助治療；具有完整的臨床資料；能積極配合隨訪。排除標準：已接受化療者；伴其他腫瘤者；伴心、肺、肝、腎功能不全者；失訪者。

1.3檢測方法 治療前，抽取2組日晨空腹靜脈血5 ml，3000 r/min離心10 min后收集血清，使用總RNA提取試劑盒(德國QIAGEN，miRNeasy Serum Kit)提取血清總RNA，使用miRNA反轉錄試劑盒(HaiGene，TaqMan miRNA Cdna Kit)反轉錄獲得cDNA，使用熒光定量聚合酶鏈式反應采用2-ΔΔCt法以U6作為內參基因檢測miRNA-187和miRNA-143表達量。操作按試劑盒說明書進行。各引物序列見表1。

表1 熒光定量聚合酶鏈式反應相關引物序列

1.4隨訪方法 采用門診或電話隨訪，隨訪時間截止至2020年6月或患者死亡。每2個月隨訪1次，記錄2組生存時間，并計算3年生存率。生存時間為確診日期到死亡日或2020年6月。

2 結果

2.12組血清miRNA-187和miRNA-143表達比較 熒光定量聚合酶鏈式反應結果表明，相較對照組，疾病組miRNA-187表達高，miRNA-143表達低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 膽囊癌患者和體檢健康志愿者血清miRNA-187和miRNA-143表達比較

2.2膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達與臨床病理特征的關系 膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達與患者性別、年齡、淋巴結轉移無關(P>0.05)，與分化程度、TNM分級有關(P<0.01)。見表3。

表3 膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達與臨床病理特征的關系

2.3血清miRNA-187和miRNA-143評估膽囊癌的受試者工作特征(ROC)曲線分析 ROC曲線分析顯示，血清miRNA-187診斷膽囊癌的截斷值為3.294，曲線下面積(AUC)為0.775；miRNA-143診斷膽囊癌截斷值為0.375，AUC為0.789。見圖1。

圖1 血清miRNA-187和miRNA-143評估膽囊癌的受試者工作特征曲線

2.4膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達與3年生存率分析 根據ROC曲線分析的miRNA-187和miRNA-143截斷值將疾病組分為miRNA-187高表達亞組47例、低表達亞組39例和miRNA-143高表達亞組38例、低表達亞組48例。Kaplan-Meire生存曲線分析顯示：miRNA-187高表達亞組3年生存率為19.15%低于低表達亞組的51.28%，miRNA-143高表達亞組3年生存率為55.26%高于低表達亞組的16.67%，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、圖3。

圖2 不同血清miRNA-187表達膽囊癌患者生存曲線

圖3 不同血清miRNA-143表達膽囊癌患者生存曲線

2.5影響膽囊癌患者3年生存率的單因素分析 單因素分析結果表明，膽囊癌患者性別、年齡、分化程度與3年生存率無關(P>0.05)，TNM分級、淋巴結轉移與3年生存率有關(P<0.05)。見表4。

表4 影響膽囊癌患者3年生存率的單因素分析[例(%)]

2.6影響膽囊癌患者3年生存率的Logistic多因素回歸分析 以膽囊癌患者3年生存率為因變量(死亡=1、存活=0)，以上述具有統計學意義的單因素為自變量進行賦值(TNM分級Ⅲ～Ⅳ級=1、Ⅰ～Ⅱ級=0，有淋巴結轉移=1、無=0，miRNA-187高表達=1、低表達=0，miRNA-143低表達=1、高表達=0)。Logistic多因素回歸分析結果顯示，TNM分級Ⅲ～Ⅳ級、淋巴結轉移、miRNA-187高表達、miRNA-143低表達是膽囊癌患者3年生存率的獨立危險因素(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 影響膽囊癌患者3年生存率的Logistic多因素回歸分析

3 討論

目前尚不清楚膽囊癌的具體致病機制，但有研究已發現女性、地理位置、種族、先天性發育異常、肥胖、膽結石個人或家族史、膽囊慢性感染及遺傳變異與膽囊癌發生率升高相關[9]。因膽囊癌患者預后較差，分析膽囊癌發病影響因素，找出早期預測指標，對本病早期干預、改善預后有重要意義。

既往研究表明，miRNA-187在多種癌癥中發揮著重要作用，然而作用結果卻不大一致。miRNA-187在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達上調，miRNA-187過表達可促進癌細胞的增殖、轉移和侵襲[10]。洪善超等[11]也報道前列腺癌患者血清miRNA-187水平升高，并在抑制表達后能降低前列腺癌細胞系增殖能力。另有研究表明，miRNA-187在人宮頸癌細胞中表達下調，其通過抑制宮頸癌細胞增殖和促進細胞凋亡發揮抑癌作用，體內實驗也證明miRNA-187能抑制小鼠宮頸癌細胞的生長[12]。Wang等[13]證明miRNA-187在結腸癌組織和細胞系中表達顯著下調，通過Kaplan-Meire生存曲線分析發現miRNA-187表達降低與結腸癌患者總生存期較短密切相關，提示miRNA-187可顯著抑制結腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲，并促進細胞凋亡。這些研究表明miRNA-187的表達具有異質性。在本研究中，膽囊癌患者血清miRNA-187表達上調，與李剛強和濮亞斌[14]研究結果一致；同時，膽囊癌患者血清miRNA-187表達與其分化程度、TNM分級有關，且miRNA-187高表達患者3年生存率更低，表明miRNA-187可能起到促癌作用。

miRNA-143被認為是膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌和胃癌等多種癌癥的抑癌因子[15]。Liu等[16]研究表明，膀胱癌患者血清中miRNA-143表達水平明顯低于健康人群，且miRNA-143表達水平與患者分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期存在相關性，miRNA-143低表達患者平均生存時間短于miRNA-143高表達患者。鄭新聞等[17]研究表明，miRNA-143是胰腺癌患者發病的保護因素，對評估患者病情及預后有一定價值。胡琛琛和張莉[18]報道指出，miRNA-143能下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，從而抑制食管癌細胞增殖。在本研究中，膽囊癌患者血清miRNA-143表達下調，其表達水平與患者分化程度、TNM分級有關，與He等[19]研究結果一致。He等[19]在體外實驗中還發現，miRNA-143能通過下調HIF-1α顯著抑制膽囊癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，阻止上皮間質轉化進程，這可能是本研究miRNA-143高表達患者3年生存率較高的原因。

膽囊癌患者大多預后不良，影響因素繁多。本研究Logistic多因素回歸分析結果表明，TNM分級Ⅲ～Ⅳ級、淋巴結轉移、miRNA-187高表達、miRNA-143低表達是膽囊癌患者3年生存率的獨立危險因素。TNM分級、淋巴結轉移對膽囊癌預后影響報道較多，在此不再贅述。胡菊梅和胡旻[20]報道miRNA-187高表達是卵巢癌患者不良預后的獨立危險因素，并指出miRNA-187高表達可能增強膽囊癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力，是膽囊癌的促癌因子，與本研究結果相似。miRNA-143能下調膽囊癌進展相關蛋白表達，在膽囊癌中起抑癌作用。因而，臨床上聯合檢測miRNA-187與miRNA-143表達對評估膽囊癌患者預后具有重要意義。

綜上所述，膽囊癌患者血清miRNA-187、miRNA-143表達與其分化程度、TNM分級有一定相關性，miRNA-187低表達、miRNA-143高表達患者3年生存率高，TNM分級Ⅲ～Ⅳ級、淋巴結轉移、miRNA-187高表達、miRNA-143低表達是膽囊癌患者預后的獨立危險因素。