薄荷提取物對提高秀麗線蟲應激抵抗能力的影響

周 琳， 馬俊鋒， 付學奇

(1． 首都師范大學 生命科學學院， 北京100048； 2． 吉林大學 生命科學學院， 長春130012)

薄荷分布廣泛[1-5]， 含有羥基肉桂酸和類黃酮等酚類化合物[6-7]. 薄荷可治療呼吸系統疾病、 胃腸道疾病、 高血壓、 糖尿病、 繼發性閉經和炎癥等[8-9]. 薄荷富含揮發油， 具有解痙、 減充血、 抗氧化和抗菌活性等作用[10-11]. 此外， 薄荷作為調味劑廣泛應用于熱茶和草藥飲料中[12]. 活性氧(ROS)是有氧代謝的產物， 有一定毒性， 可產生病理作用. 在免疫應答和細胞信號轉導中， ROS與核酸、 蛋白質和脂質等許多生物分子發生相互作用. 如果人體的ROS失衡， 可導致衰老、 發炎、 癌癥等[13-15]. 由于ROS在細胞中有雙重作用， 因此機體中抗氧化防御系統的存在至關重要. 該防御系統由超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶[16]、 內源性肽及食物來源的營養化合物等組成[17]. 隨著年齡增長， 與抗氧化防御相關的體內機制逐漸受到損害， 因此人體可能積累一定的ROS， 導致衰老及與年齡有關的疾病發生[18].

秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans， 線蟲)是一種用于抗逆性和抗衰老研究的優秀模型生物[19-20]. 線蟲具有生命周期短、 易操作、 通體透明易觀察、 細胞譜系完全確定等優點. 在基因組水平上， 線蟲與人的同源性約為80%[21-22]. 目前， 研究人員已將線蟲模型應用于藥理學研究， 并發現了許多藥物化合物與基因相互作用的關系[23]. 本文應用線蟲模型分析薄荷提取物對其應激抵抗性的影響， 為人類疾病的治療和預防提供理論依據.

1 材料和方法

1.1 化學試劑

胡桃醌、 DCFH-DA和迷迭香酸(C18H16O8， 質量分數>98%， HPLC級)購自上海源葉生物科技有限公司； 疊氮化鈉購自北京化工廠. SOD活性檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司； RNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司； 逆轉錄和qPCR試劑盒購自北京全式金生物有限公司.

1.2 薄荷提取物

薄荷購自吉林大藥房， 用沸水提取獲得水溶液. 將5 g薄荷研磨， 過14目篩， 然后加入50 mL去離子水， 煮沸20 min. 收集濾液， 再加入50 mL去離子水， 繼續煮沸20 min. 上述步驟重復3次， 合并濾液， 蒸發或添加去離子水至50 mL， 殘余的薄荷質量為3 g. 因此， 提取物的質量濃度為40 g/L. 用0.22 μm濾膜過濾， -80 ℃保存. 將迷迭香酸溶解于去離子水中， 制成500 μmol/L的儲備溶液， 然后將其添加到線蟲生長培養基(NGM)和Ecoil.OP50中至終濃度為200 μmol/L.

1.3 線蟲株和培養基

線蟲株均來自秀麗線蟲遺傳學中心(CGC)： N2(野生型)， CF1588 (daf-16(mu86) Ⅰ；daf-2(e1370) Ⅲ； muⅠs84), CF1038 (daf-16(mu86)Ⅰ), TJ356 (zⅠs356 [daf-16p∷daf-16a/b∷GFP+rol-6]), CF1553 (muⅠs84 [(pAD76)sod-3p∷GFP+rol-6]). 將線蟲置于含有NGM(質量分數為1.7%的瓊脂， 2.5 μg/mL蛋白胨， 50 mmol/L NaCl, 25 mmol/L K2HPO4, pH=6.0, 1 mmol/L MgSO4, 1 mmol/L CaCl2和5 μg/mL膽固醇)的培養皿中培養， 環境溫度為20 ℃， 以Ecoil.OP50為食喂養. 薄荷培養基為在NGM中加入薄荷提取物至相應濃度， 在涂布時將薄荷提取物加入Ecoil.OP50中至相應濃度后進行涂布.

1.4 應激抵抗實驗

將同期化后的線蟲置于20 ℃ NGM/OP50上培養， 96 h后將其轉移至薄荷培養基內繼續培養， 48 h后用M9緩沖液(1 mmol/L MgSO4, 42 mmol/L Na2HPO4, 22 mmol/L KH2PO4, 85 mmol/L NaCl)收集線蟲， 反復沖洗3次, 洗去線蟲體表粘附的Ecoil.OP50， 然后將線蟲轉移至無Ecoil.OP50的NGM中. 分別給予線蟲不同條件的外界刺激(紫外輻射、 綠膿桿菌感染、 35 ℃熱應激)后， 將線蟲轉移回NGM/OP50并在20 ℃下培養; 胡桃醌氧化應激實驗需將胡桃醌加入線蟲液體培養基(0.01 mmol/L膽固醇, 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L K2HPO4, pH=6.0)中， 所有實驗均至少重復3次.

1) 紫外輻射實驗. 將線蟲置于2個254 nm, 1 000 J/m2, 15 W紫外燈下8 min 20 s. 紫外照射后， 將線蟲放回NGM/OP50中， 20 ℃培養， 每12 h觀察一次存活情況, 每組n>60.

2) 綠膿桿菌感染實驗. 當線蟲培養144 h時， 將其轉移到涂有綠膿桿菌PA14菌株的NGM/OP50上， 20 ℃培養， 每天觀察一次存活情況. 綠膿桿菌培養基制備方法為將20 μL對數生長期綠膿桿菌菌液涂布在NGM/OP50上， 在20 ℃下干燥過夜后使用， 每組n>60.

3) 35 ℃熱應激實驗. 當線蟲培養144 h時， 將其轉移至35 ℃環境下培養， 每1 h觀察一次存活情況, 每組n>70.

4) 胡桃醌氧化實驗. 參照文獻[24]方法， 當線蟲培養144 h時轉入96孔板， 每孔均包含200 μL液體培養基， 實驗組加入胡桃醌至終濃度為200 μmol/L， 每孔放置1條線蟲， 每1 h觀察一次存活情況, 每組n>80.

1.5 ROS水平測定

當線蟲孵化至第96 h， 將其隨機分為5組. 第1，2組線蟲繼續在NGM/OP50培養基上培養， 第3，4，5組轉移至不同濃度薄荷培養基上培養. 144 h后給予線蟲紫外輻射刺激， 用200 μmol/L DCFH-DA收集線蟲， 于20 ℃浸泡30 min后， 將其轉移至含200 μL M9緩沖液黑色96孔板中， 每孔20條線蟲. 用Infinite F200 Pro型酶標儀(瑞士Tecan公司產品； 激發波長485 nm， 發射波長535 nm)測量吸光度. ROS水平表征為相對第2組的平均吸光度， 將其相對熒光單位(RFU)的平均值設置為1以反映相對ROS水平， 實驗至少重復3次.

1.6 SOD活性測定

紫外輻射后， 用500 μL M9緩沖液收集線蟲， 每組500條. 然后用超聲細胞破碎儀進行破碎， 并用SOD活性檢測試劑盒測量SOD活性， 實驗至少重復3次.

1.7 突變體線蟲紫外輻射抵抗實驗

用突變體線蟲CF1588和CF1038進行紫外輻射抵抗實驗[25]， 實驗方法與1.4相同.

1.8 DAF-16∷GFP細胞定位和SOD-3∷GFP表達量測定

用轉基因線蟲TJ356和CF1553進行實驗， 紫外輻射后， 立即用100 mmol/L疊氮化鈉將線蟲固定在載玻片上. 用Olympus IX73型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察DAF-16∷GFP細胞內定位情況和SOD-3∷GFP表達量.

1.9 實時定量PCR(qRT-PCR)

紫外輻射后， 用500 μL M9緩沖液收集線蟲并反復沖洗3次， 每組300條. 用試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取總RNA， 并逆轉錄為cDNA(北京全式金生物有限公司)， 用SYBR Green(北京全式金生物有限公司)和ABI 7500 qPCR儀(美國Applied Biosystems公司)進行qRT-PCR分析. 用ΔΔCt方法計算相對倍數變化， 以act-1基因為內參， 實驗至少重復3次. qPCR引物如下:

daf-16，5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′和5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′；

sod-3，5′-AGCATCATGCCACCTACGTGA-3′和5′-CACCACCATTGAATTTCAGCG-3′；

hsp-12.6，5′-TGGCCACTTCAAAAGGGAG-3′和5′-CTCTTTTGGGAGGAAGTTATGG-3′；

hsp-16.1，5′-CCACTATTTCCGTCCAGCTC-3′和5′-TGGAGAGCCTCTGCAAACTG-3′；

hsp-16.49,5′-GTCAAATCTGCAATTTCGAATG-3′和5′-CAAAATTAATGGGAATAGAACGAG-3′.

1.10 運動狀態檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養72 h后， 轉移至不同濃度薄荷培養基中， 每組100條. 在成蟲的第10，12，14，16天觀察線蟲的運動狀態. 將不經外界刺激即可自主運動的線蟲歸為A類， 經外界刺激后才能自主運動的線蟲歸為B類， 經外界刺激后也不能自主運動的線蟲歸為C類， 死亡線蟲歸為D類[26-27].

1.11 吞咽頻率檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養72 h后， 轉移至不同濃度薄荷培養基中， 每組10條. 在成蟲的第10，12，14，16天觀察記錄線蟲1 min的吞咽次數[28].

1.12 壽命檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養72 h后， 轉移至不同濃度薄荷培養基中， 每組90條. 每天觀察并記錄線蟲存活情況. 陰道破裂、 丟失、 貼壁的線蟲不計入統計， 實驗至少重復3次.

1.13 育雛數檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養L4期后， 轉移至不同濃度薄荷培養基中， 每組10條， 每個培養皿內1條. 每隔24 h將線蟲轉移至新培養基內， 直到停止產卵. 計算每條線蟲的產卵孵化總數， 每組取平均值[29].

1.14 統計分析

用Prism 5軟件(美國GraphPad Software公司)中的Kaplan-Meier生存測定法繪制生存曲線， 并通過log-rank (Mantel-cox) test進行數據分析. 其他數據用ANOVA進行統計分析， 結果表示為平均值±標準誤差(SEM).p<0.05為有統計學意義， 無顯著性差異的組標記為N(0.05≤p標記為N， 0.01≤p<0.05標記為*， 0.001≤p<0.01標記為**，p<0.001標記為***).

2 結果與討論

2.1 薄荷提取物對線蟲應激抵抗能力的影響

在紫外輻射抵抗實驗中， 薄荷提取物處理后的線蟲經紫外輻照后平均壽命超過80 h， 對照組的壽命約為56 h. 實驗組線蟲的半數存活時間(96 h)是對照組(48 h)的兩倍. 與對照組相比， 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理后的線蟲平均存活時間分別增加了48%，45%，49%， 如圖1(A)所示. 在綠膿桿菌抵抗實驗中， 對照組線蟲平均存活時間為(6.81±3.23)d， 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理的線蟲平均存活時間均延長， 分別為(8.11±2.91)，(8.55±3.14)，(8.97±2.58)d， 如圖1(B)所示. 在35 ℃熱應激抵抗實驗中， 用10 g/L薄荷提取物處理的線蟲平均存活時間為(6.19±1.80)h， 對照組線蟲平均存活時間為(5.15±2.16)h， 與對照組相比出現顯著差異， 如圖1(C)所示. 在胡桃醌氧化實驗中， 對照組線蟲平均存活時間為(9.09±3.53)h(最長15 h)， 用2.5,5,10 g/L薄荷提取物處理的線蟲平均存活時間為(9.52±3.38)h(最長15 h), (9.17±4.09)h(最長16 h)和(10.36±3.48)h(最長15 h). 與對照組相比， 10 g/L薄荷提取物處理組線蟲平均存活時間顯著增加， 如圖1(D)所示.

根據上述實驗結果， 薄荷提取物使線蟲對紫外輻射的抵抗性增強最明顯. 因此， 本文以紫外輻射為應激源， 進一步分析薄荷提取物提高線蟲紫外輻射應激抵抗能力的作用機制. 由于薄荷中水溶性成分主要為多酚類物質， 因此選擇抗氧化劑活性成分迷迭香酸作為陽性對照[30]. 實驗結果表明， 與對照組相比， 用200 μmol/L迷迭香酸處理的線蟲具有抗紫外輻射的能力， 如圖1(E)所示, 因此推測薄荷提取物中含有一些與迷迭香酸結構相似的多酚類物質在發揮作用.

圖1 薄荷提取物對線蟲應激抵抗能力的影響

2.2 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內ROS水平和SOD活性的影響

為分析薄荷提取物提高線蟲抗紫外輻射能力的原因， 本文首先檢測了紫外輻射后線蟲體內ROS含量和SOD活性. 當生物體受紫外輻射時， 過量ROS會打破機體穩態， 導致細胞內氧化應激反應， 進而加速細胞凋亡[31]. SOD是生物體中抗氧化酶系的重要組成部分， 可保護機體免受ROS侵害[32-33]. 圖2為薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內ROS水平和SOD活性的影響.

a. 0; b. 0+UV; C.2.5 g/L+UV; d. 5 g/L+UV; e. 10 g/L+UV.

由圖2(A)可見， 與對照組相比， 實驗組熒光強度明顯降低， 用2.5，5，10 g/L的薄荷提取物處理線蟲的ROS水平顯著降低， 分別降至對照組的94.1%，86.7%，79.5%, 表明薄荷提取物有效減少了紫外輻射后線蟲體內ROS的累積. 由圖2(B)可見， 經紫外輻射后， 對照組線蟲SOD活性為(3.668±0.392)RFU/mg， 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理后， 線蟲的SOD活性分別為(4.737±0.361)，(5.302±0.279)，6.299 RFU/mg. 在第1組中， 線蟲僅在NGM/OP50上生長且不經紫外照射， 測得其SOD活性為(0.761±0.447)RFU/mg， 用于對照檢查實驗環境. 實驗結果表明， 與對照組相比， 薄荷提取物可提高紫外輻射后線蟲體內SOD活性.

2.3 薄荷提取物抗紫外輻射功能與胰島素/IGF-1樣信號通路的關系

由于daf-2和daf-16是胰島素/IGF-1樣信號通路中的關鍵基因， 因此以雙突變體線蟲CF1588和單突變體線蟲CF1038為研究對象， 研究薄荷抗紫外輻射的作用機制， 結果如圖3所示. 由圖3可見， 與對照組相比， 薄荷提取物未提高這兩種突變體的紫外輻射抵抗性. 因此， 薄荷提取物增強線蟲紫外輻射抵抗性的作用可能與胰島素/IGF-1樣信號通路有關.

圖3 薄荷提取物對突變體線蟲抗紫外輻射能力的影響

2.4 薄荷提取物對紫外輻射后DAF-16細胞核定位和SOD-3表達的影響

以轉基因線蟲TJ356為研究對象， 研究薄荷提取物對線蟲體內DAF-16細胞核定位的影響, 結果如圖4所示. 將DAF-16∷GFP在細胞核內的位置分為3種: 細胞核、 細胞質和二者之間[34]. 由圖4可見， 經紫外輻射后， 對照組線蟲DAF-16主要定位于細胞質內， 實驗組線蟲體內DAF-16細胞核定位及細胞質核間的定位數量明顯增多. 因此， 薄荷提取物可能是通過促進DAF-16向細胞核內轉移增強其紫外輻射抵抗性.

圖4 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內DAF-16向細胞核定位的促進作用

以轉基因線蟲CF1553為研究對象， 研究薄荷提取物對線蟲體內SOD-3表達量的影響, 結果如圖5所示. 由圖5可見， 經紫外輻射后， 與對照組相比， 實驗組線蟲體內SOD-3表達量明顯增多. 因此， 薄荷提取物可能是通過提供SOD-3的表達量增強其紫外輻射抵抗性. 圖4和圖5的數據統計結果分別如圖6和圖7所示.

圖5 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內SOD-3表達量的影響

2.5 薄荷提取物對增加daf-16下游基因 mRNA水平表達量的影響

研究表明DAF-16可激活許多下游靶基因的表達， 包括sod-3,hsp-12.6,hsp-16.1和hsp-16.49等[35-37]. 為進一步探究薄荷提取物增強線蟲紫外輻射抵抗性的作用機制， 本文檢測了daf-16及其下游部分靶基因sod-3,hsp-12.6,hsp-16.1和hsp-16.49 mRNA水平表達量. 與對照組相比， 用10 g/L薄荷提取物處理線蟲的sod-3,hsp-12.6,-hsp-16.1和hsp-16.49 mRNA水平表達量明顯上升， 但daf-16的表達量無明顯差異, 如圖8所示. 表明薄荷提取物至少部分通過胰島素/IGF-1樣信號通路調控DAF-16的細胞內定位及其靶基因的表達量， 進而影響線蟲的紫外輻射抵抗能力.

a. 0; b. 0+UV; c. 2.5 g/L+UV; d. 5 g/L+UV; e. 10 g/L+UV.

a. 0; b. 0+UV; c. 2.5 g/L+UV; d. 5 g/L+UV; e. 10 g/L+UV.

圖8 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內應激相關基因表達量的影響

2.6 薄荷提取物對線蟲運動能力和吞咽頻率的影響

薄荷提取物對線蟲運動能力的影響如圖9所示. 由圖9可見， 與對照組相比， 實驗組線蟲自主運動能力明顯增強， 且呈劑量依賴性. 在第10天， 大多數線蟲均能自主運動， 但實驗組線蟲運動更活躍. 在第12天， 實驗組線蟲明顯具有較高的運動能力， A類和B類線蟲的比例較高， 對照組線蟲大多數為C類. 在第14天， 劑量依賴性對運動的影響更明顯， 對照組線蟲有79.4%為B類、 20.6%為C類， 實驗組線蟲大多數為A類或B類. 在第16天， 90.9%的對照組線蟲為C類， 而50%以上的實驗組線蟲仍為A類.

圖9 薄荷提取物對線蟲運動能力的影響

薄荷提取物對成年線蟲吞咽頻率的影響如圖10所示. 由圖10可見， 與對照組相比， 實驗組線蟲吞咽頻率明顯增加. 在第10，12，14天， 實驗組略高于對照組線蟲的吞咽頻率. 在第16天， 2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理組分別高于對照組線蟲吞咽頻率64%，88%，109%， 有明顯差異. 這些數據表明， 薄荷提取物可明顯提高成年線蟲的吞咽頻率.

圖10 薄荷提取物對線蟲吞咽能力的影響

2.7 薄荷提取物對實驗條件下線蟲壽命和育雛數的影響

薄荷提取物對實驗條件下線蟲壽命和育雛數的影響如圖11所示. 由圖11(A)可見， 對照組線蟲的平均壽命為(17.30±2.05)d (最長21 d). 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理線蟲的平均壽命分別為(17.13±3.07)d(最長21 d)、 (17.29±3.05)d(最長22 d)和(16.65±2.08)d(最長21 d). 因此， 薄荷提取物對線蟲壽命無明顯影響. 由圖11(B)可見， 與對照組相比， 實驗組線蟲育雛數無明顯變化， 表明薄荷提取物不損害其生育能力.

圖11 實驗條件下薄荷提取物對線蟲壽命(A)和育雛數(B)的影響

綜上所述， 本文研究了薄荷提取物對線蟲抵抗多種應激能力的影響， 并以紫外輻射為應激源， 研究了薄荷提取物增強線蟲紫外輻射抵抗性的作用機制. 實驗結果表明： 薄荷提取物可減少線蟲體內ROS積累并增強SOD活性； 薄荷提取物提高線蟲紫外輻射抵抗能力與胰島素/IGF-1樣信號通路有關; 薄荷提取物增加了紫外輻射后DAF-16的細胞核定位和SOD-3表達量， 并增加了daf-16下游部分基因sod-3,hsp-12.6,hsp-16.1和hsp-16.49的mRNA水平表達量， 即薄荷提取物可通過DAF-16發揮抗紫外輻射作用; 薄荷提取物可改善線蟲肌肉功能， 增強成年線蟲的運動能力并增加其吞咽頻率， 且在實驗條件下， 薄荷提取物不損害線蟲壽命和生育能力.