薄荷提取物對提高秀麗線蟲應(yīng)激抵抗能力的影響

周 琳， 馬俊鋒， 付學(xué)奇

(1． 首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 北京100048； 2． 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 長春130012)

薄荷分布廣泛[1-5]， 含有羥基肉桂酸和類黃酮等酚類化合物[6-7]. 薄荷可治療呼吸系統(tǒng)疾病、 胃腸道疾病、 高血壓、 糖尿病、 繼發(fā)性閉經(jīng)和炎癥等[8-9]. 薄荷富含揮發(fā)油， 具有解痙、 減充血、 抗氧化和抗菌活性等作用[10-11]. 此外， 薄荷作為調(diào)味劑廣泛應(yīng)用于熱茶和草藥飲料中[12]. 活性氧(ROS)是有氧代謝的產(chǎn)物， 有一定毒性， 可產(chǎn)生病理作用. 在免疫應(yīng)答和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中， ROS與核酸、 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等許多生物分子發(fā)生相互作用. 如果人體的ROS失衡， 可導(dǎo)致衰老、 發(fā)炎、 癌癥等[13-15]. 由于ROS在細胞中有雙重作用， 因此機體中抗氧化防御系統(tǒng)的存在至關(guān)重要. 該防御系統(tǒng)由超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶[16]、 內(nèi)源性肽及食物來源的營養(yǎng)化合物等組成[17]. 隨著年齡增長， 與抗氧化防御相關(guān)的體內(nèi)機制逐漸受到損害， 因此人體可能積累一定的ROS， 導(dǎo)致衰老及與年齡有關(guān)的疾病發(fā)生[18].

秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans， 線蟲)是一種用于抗逆性和抗衰老研究的優(yōu)秀模型生物[19-20]. 線蟲具有生命周期短、 易操作、 通體透明易觀察、 細胞譜系完全確定等優(yōu)點. 在基因組水平上， 線蟲與人的同源性約為80%[21-22]. 目前， 研究人員已將線蟲模型應(yīng)用于藥理學(xué)研究， 并發(fā)現(xiàn)了許多藥物化合物與基因相互作用的關(guān)系[23]. 本文應(yīng)用線蟲模型分析薄荷提取物對其應(yīng)激抵抗性的影響， 為人類疾病的治療和預(yù)防提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 化學(xué)試劑

胡桃醌、 DCFH-DA和迷迭香酸(C18H16O8， 質(zhì)量分數(shù)>98%， HPLC級)購自上海源葉生物科技有限公司； 疊氮化鈉購自北京化工廠. SOD活性檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司； RNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司； 逆轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒購自北京全式金生物有限公司.

1.2 薄荷提取物

薄荷購自吉林大藥房， 用沸水提取獲得水溶液. 將5 g薄荷研磨， 過14目篩， 然后加入50 mL去離子水， 煮沸20 min. 收集濾液， 再加入50 mL去離子水， 繼續(xù)煮沸20 min. 上述步驟重復(fù)3次， 合并濾液， 蒸發(fā)或添加去離子水至50 mL， 殘余的薄荷質(zhì)量為3 g. 因此， 提取物的質(zhì)量濃度為40 g/L. 用0.22 μm濾膜過濾， -80 ℃保存. 將迷迭香酸溶解于去離子水中， 制成500 μmol/L的儲備溶液， 然后將其添加到線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)和Ecoil.OP50中至終濃度為200 μmol/L.

1.3 線蟲株和培養(yǎng)基

線蟲株均來自秀麗線蟲遺傳學(xué)中心(CGC)： N2(野生型)， CF1588 (daf-16(mu86) Ⅰ；daf-2(e1370) Ⅲ； muⅠs84), CF1038 (daf-16(mu86)Ⅰ), TJ356 (zⅠs356 [daf-16p∷daf-16a/b∷GFP+rol-6]), CF1553 (muⅠs84 [(pAD76)sod-3p∷GFP+rol-6]). 將線蟲置于含有NGM(質(zhì)量分數(shù)為1.7%的瓊脂， 2.5 μg/mL蛋白胨， 50 mmol/L NaCl, 25 mmol/L K2HPO4, pH=6.0, 1 mmol/L MgSO4, 1 mmol/L CaCl2和5 μg/mL膽固醇)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)， 環(huán)境溫度為20 ℃， 以Ecoil.OP50為食喂養(yǎng). 薄荷培養(yǎng)基為在NGM中加入薄荷提取物至相應(yīng)濃度， 在涂布時將薄荷提取物加入Ecoil.OP50中至相應(yīng)濃度后進行涂布.

1.4 應(yīng)激抵抗實驗

將同期化后的線蟲置于20 ℃ NGM/OP50上培養(yǎng)， 96 h后將其轉(zhuǎn)移至薄荷培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)， 48 h后用M9緩沖液(1 mmol/L MgSO4, 42 mmol/L Na2HPO4, 22 mmol/L KH2PO4, 85 mmol/L NaCl)收集線蟲， 反復(fù)沖洗3次, 洗去線蟲體表粘附的Ecoil.OP50， 然后將線蟲轉(zhuǎn)移至無Ecoil.OP50的NGM中. 分別給予線蟲不同條件的外界刺激(紫外輻射、 綠膿桿菌感染、 35 ℃熱應(yīng)激)后， 將線蟲轉(zhuǎn)移回NGM/OP50并在20 ℃下培養(yǎng); 胡桃醌氧化應(yīng)激實驗需將胡桃醌加入線蟲液體培養(yǎng)基(0.01 mmol/L膽固醇, 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L K2HPO4, pH=6.0)中， 所有實驗均至少重復(fù)3次.

1) 紫外輻射實驗. 將線蟲置于2個254 nm, 1 000 J/m2, 15 W紫外燈下8 min 20 s. 紫外照射后， 將線蟲放回NGM/OP50中， 20 ℃培養(yǎng)， 每12 h觀察一次存活情況, 每組n>60.

2) 綠膿桿菌感染實驗. 當(dāng)線蟲培養(yǎng)144 h時， 將其轉(zhuǎn)移到涂有綠膿桿菌PA14菌株的NGM/OP50上， 20 ℃培養(yǎng)， 每天觀察一次存活情況. 綠膿桿菌培養(yǎng)基制備方法為將20 μL對數(shù)生長期綠膿桿菌菌液涂布在NGM/OP50上， 在20 ℃下干燥過夜后使用， 每組n>60.

3) 35 ℃熱應(yīng)激實驗. 當(dāng)線蟲培養(yǎng)144 h時， 將其轉(zhuǎn)移至35 ℃環(huán)境下培養(yǎng)， 每1 h觀察一次存活情況, 每組n>70.

4) 胡桃醌氧化實驗. 參照文獻[24]方法， 當(dāng)線蟲培養(yǎng)144 h時轉(zhuǎn)入96孔板， 每孔均包含200 μL液體培養(yǎng)基， 實驗組加入胡桃醌至終濃度為200 μmol/L， 每孔放置1條線蟲， 每1 h觀察一次存活情況, 每組n>80.

1.5 ROS水平測定

當(dāng)線蟲孵化至第96 h， 將其隨機分為5組. 第1，2組線蟲繼續(xù)在NGM/OP50培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 第3，4，5組轉(zhuǎn)移至不同濃度薄荷培養(yǎng)基上培養(yǎng). 144 h后給予線蟲紫外輻射刺激， 用200 μmol/L DCFH-DA收集線蟲， 于20 ℃浸泡30 min后， 將其轉(zhuǎn)移至含200 μL M9緩沖液黑色96孔板中， 每孔20條線蟲. 用Infinite F200 Pro型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司產(chǎn)品； 激發(fā)波長485 nm， 發(fā)射波長535 nm)測量吸光度. ROS水平表征為相對第2組的平均吸光度， 將其相對熒光單位(RFU)的平均值設(shè)置為1以反映相對ROS水平， 實驗至少重復(fù)3次.

1.6 SOD活性測定

紫外輻射后， 用500 μL M9緩沖液收集線蟲， 每組500條. 然后用超聲細胞破碎儀進行破碎， 并用SOD活性檢測試劑盒測量SOD活性， 實驗至少重復(fù)3次.

1.7 突變體線蟲紫外輻射抵抗實驗

用突變體線蟲CF1588和CF1038進行紫外輻射抵抗實驗[25]， 實驗方法與1.4相同.

1.8 DAF-16∷GFP細胞定位和SOD-3∷GFP表達量測定

用轉(zhuǎn)基因線蟲TJ356和CF1553進行實驗， 紫外輻射后， 立即用100 mmol/L疊氮化鈉將線蟲固定在載玻片上. 用Olympus IX73型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察DAF-16∷GFP細胞內(nèi)定位情況和SOD-3∷GFP表達量.

1.9 實時定量PCR(qRT-PCR)

紫外輻射后， 用500 μL M9緩沖液收集線蟲并反復(fù)沖洗3次， 每組300條. 用試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取總RNA， 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(北京全式金生物有限公司)， 用SYBR Green(北京全式金生物有限公司)和ABI 7500 qPCR儀(美國Applied Biosystems公司)進行qRT-PCR分析. 用ΔΔCt方法計算相對倍數(shù)變化， 以act-1基因為內(nèi)參， 實驗至少重復(fù)3次. qPCR引物如下:

daf-16，5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′和5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′；

sod-3，5′-AGCATCATGCCACCTACGTGA-3′和5′-CACCACCATTGAATTTCAGCG-3′；

hsp-12.6，5′-TGGCCACTTCAAAAGGGAG-3′和5′-CTCTTTTGGGAGGAAGTTATGG-3′；

hsp-16.1，5′-CCACTATTTCCGTCCAGCTC-3′和5′-TGGAGAGCCTCTGCAAACTG-3′；

hsp-16.49,5′-GTCAAATCTGCAATTTCGAATG-3′和5′-CAAAATTAATGGGAATAGAACGAG-3′.

1.10 運動狀態(tài)檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養(yǎng)72 h后， 轉(zhuǎn)移至不同濃度薄荷培養(yǎng)基中， 每組100條. 在成蟲的第10，12，14，16天觀察線蟲的運動狀態(tài). 將不經(jīng)外界刺激即可自主運動的線蟲歸為A類， 經(jīng)外界刺激后才能自主運動的線蟲歸為B類， 經(jīng)外界刺激后也不能自主運動的線蟲歸為C類， 死亡線蟲歸為D類[26-27].

1.11 吞咽頻率檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養(yǎng)72 h后， 轉(zhuǎn)移至不同濃度薄荷培養(yǎng)基中， 每組10條. 在成蟲的第10，12，14，16天觀察記錄線蟲1 min的吞咽次數(shù)[28].

1.12 壽命檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養(yǎng)72 h后， 轉(zhuǎn)移至不同濃度薄荷培養(yǎng)基中， 每組90條. 每天觀察并記錄線蟲存活情況. 陰道破裂、 丟失、 貼壁的線蟲不計入統(tǒng)計， 實驗至少重復(fù)3次.

1.13 育雛數(shù)檢測

將線蟲在20 ℃ NGM/OP50上培養(yǎng)L4期后， 轉(zhuǎn)移至不同濃度薄荷培養(yǎng)基中， 每組10條， 每個培養(yǎng)皿內(nèi)1條. 每隔24 h將線蟲轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基內(nèi)， 直到停止產(chǎn)卵. 計算每條線蟲的產(chǎn)卵孵化總數(shù)， 每組取平均值[29].

1.14 統(tǒng)計分析

用Prism 5軟件(美國GraphPad Software公司)中的Kaplan-Meier生存測定法繪制生存曲線， 并通過log-rank (Mantel-cox) test進行數(shù)據(jù)分析. 其他數(shù)據(jù)用ANOVA進行統(tǒng)計分析， 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM).p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義， 無顯著性差異的組標(biāo)記為N(0.05≤p標(biāo)記為N， 0.01≤p<0.05標(biāo)記為*， 0.001≤p<0.01標(biāo)記為**，p<0.001標(biāo)記為***).

2 結(jié)果與討論

2.1 薄荷提取物對線蟲應(yīng)激抵抗能力的影響

在紫外輻射抵抗實驗中， 薄荷提取物處理后的線蟲經(jīng)紫外輻照后平均壽命超過80 h， 對照組的壽命約為56 h. 實驗組線蟲的半數(shù)存活時間(96 h)是對照組(48 h)的兩倍. 與對照組相比， 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理后的線蟲平均存活時間分別增加了48%，45%，49%， 如圖1(A)所示. 在綠膿桿菌抵抗實驗中， 對照組線蟲平均存活時間為(6.81±3.23)d， 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理的線蟲平均存活時間均延長， 分別為(8.11±2.91)，(8.55±3.14)，(8.97±2.58)d， 如圖1(B)所示. 在35 ℃熱應(yīng)激抵抗實驗中， 用10 g/L薄荷提取物處理的線蟲平均存活時間為(6.19±1.80)h， 對照組線蟲平均存活時間為(5.15±2.16)h， 與對照組相比出現(xiàn)顯著差異， 如圖1(C)所示. 在胡桃醌氧化實驗中， 對照組線蟲平均存活時間為(9.09±3.53)h(最長15 h)， 用2.5,5,10 g/L薄荷提取物處理的線蟲平均存活時間為(9.52±3.38)h(最長15 h), (9.17±4.09)h(最長16 h)和(10.36±3.48)h(最長15 h). 與對照組相比， 10 g/L薄荷提取物處理組線蟲平均存活時間顯著增加， 如圖1(D)所示.

根據(jù)上述實驗結(jié)果， 薄荷提取物使線蟲對紫外輻射的抵抗性增強最明顯. 因此， 本文以紫外輻射為應(yīng)激源， 進一步分析薄荷提取物提高線蟲紫外輻射應(yīng)激抵抗能力的作用機制. 由于薄荷中水溶性成分主要為多酚類物質(zhì)， 因此選擇抗氧化劑活性成分迷迭香酸作為陽性對照[30]. 實驗結(jié)果表明， 與對照組相比， 用200 μmol/L迷迭香酸處理的線蟲具有抗紫外輻射的能力， 如圖1(E)所示, 因此推測薄荷提取物中含有一些與迷迭香酸結(jié)構(gòu)相似的多酚類物質(zhì)在發(fā)揮作用.

圖1 薄荷提取物對線蟲應(yīng)激抵抗能力的影響

2.2 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內(nèi)ROS水平和SOD活性的影響

為分析薄荷提取物提高線蟲抗紫外輻射能力的原因， 本文首先檢測了紫外輻射后線蟲體內(nèi)ROS含量和SOD活性. 當(dāng)生物體受紫外輻射時， 過量ROS會打破機體穩(wěn)態(tài)， 導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)， 進而加速細胞凋亡[31]. SOD是生物體中抗氧化酶系的重要組成部分， 可保護機體免受ROS侵害[32-33]. 圖2為薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內(nèi)ROS水平和SOD活性的影響.

a. 0; b. 0+UV; C.2.5 g/L+UV; d. 5 g/L+UV; e. 10 g/L+UV.

由圖2(A)可見， 與對照組相比， 實驗組熒光強度明顯降低， 用2.5，5，10 g/L的薄荷提取物處理線蟲的ROS水平顯著降低， 分別降至對照組的94.1%，86.7%，79.5%, 表明薄荷提取物有效減少了紫外輻射后線蟲體內(nèi)ROS的累積. 由圖2(B)可見， 經(jīng)紫外輻射后， 對照組線蟲SOD活性為(3.668±0.392)RFU/mg， 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理后， 線蟲的SOD活性分別為(4.737±0.361)，(5.302±0.279)，6.299 RFU/mg. 在第1組中， 線蟲僅在NGM/OP50上生長且不經(jīng)紫外照射， 測得其SOD活性為(0.761±0.447)RFU/mg， 用于對照檢查實驗環(huán)境. 實驗結(jié)果表明， 與對照組相比， 薄荷提取物可提高紫外輻射后線蟲體內(nèi)SOD活性.

2.3 薄荷提取物抗紫外輻射功能與胰島素/IGF-1樣信號通路的關(guān)系

由于daf-2和daf-16是胰島素/IGF-1樣信號通路中的關(guān)鍵基因， 因此以雙突變體線蟲CF1588和單突變體線蟲CF1038為研究對象， 研究薄荷抗紫外輻射的作用機制， 結(jié)果如圖3所示. 由圖3可見， 與對照組相比， 薄荷提取物未提高這兩種突變體的紫外輻射抵抗性. 因此， 薄荷提取物增強線蟲紫外輻射抵抗性的作用可能與胰島素/IGF-1樣信號通路有關(guān).

圖3 薄荷提取物對突變體線蟲抗紫外輻射能力的影響

2.4 薄荷提取物對紫外輻射后DAF-16細胞核定位和SOD-3表達的影響

以轉(zhuǎn)基因線蟲TJ356為研究對象， 研究薄荷提取物對線蟲體內(nèi)DAF-16細胞核定位的影響, 結(jié)果如圖4所示. 將DAF-16∷GFP在細胞核內(nèi)的位置分為3種: 細胞核、 細胞質(zhì)和二者之間[34]. 由圖4可見， 經(jīng)紫外輻射后， 對照組線蟲DAF-16主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)， 實驗組線蟲體內(nèi)DAF-16細胞核定位及細胞質(zhì)核間的定位數(shù)量明顯增多. 因此， 薄荷提取物可能是通過促進DAF-16向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移增強其紫外輻射抵抗性.

圖4 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內(nèi)DAF-16向細胞核定位的促進作用

以轉(zhuǎn)基因線蟲CF1553為研究對象， 研究薄荷提取物對線蟲體內(nèi)SOD-3表達量的影響, 結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見， 經(jīng)紫外輻射后， 與對照組相比， 實驗組線蟲體內(nèi)SOD-3表達量明顯增多. 因此， 薄荷提取物可能是通過提供SOD-3的表達量增強其紫外輻射抵抗性. 圖4和圖5的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果分別如圖6和圖7所示.

圖5 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內(nèi)SOD-3表達量的影響

2.5 薄荷提取物對增加daf-16下游基因 mRNA水平表達量的影響

研究表明DAF-16可激活許多下游靶基因的表達， 包括sod-3,hsp-12.6,hsp-16.1和hsp-16.49等[35-37]. 為進一步探究薄荷提取物增強線蟲紫外輻射抵抗性的作用機制， 本文檢測了daf-16及其下游部分靶基因sod-3,hsp-12.6,hsp-16.1和hsp-16.49 mRNA水平表達量. 與對照組相比， 用10 g/L薄荷提取物處理線蟲的sod-3,hsp-12.6,-hsp-16.1和hsp-16.49 mRNA水平表達量明顯上升， 但daf-16的表達量無明顯差異, 如圖8所示. 表明薄荷提取物至少部分通過胰島素/IGF-1樣信號通路調(diào)控DAF-16的細胞內(nèi)定位及其靶基因的表達量， 進而影響線蟲的紫外輻射抵抗能力.

a. 0; b. 0+UV; c. 2.5 g/L+UV; d. 5 g/L+UV; e. 10 g/L+UV.

a. 0; b. 0+UV; c. 2.5 g/L+UV; d. 5 g/L+UV; e. 10 g/L+UV.

圖8 薄荷提取物對紫外輻射后線蟲體內(nèi)應(yīng)激相關(guān)基因表達量的影響

2.6 薄荷提取物對線蟲運動能力和吞咽頻率的影響

薄荷提取物對線蟲運動能力的影響如圖9所示. 由圖9可見， 與對照組相比， 實驗組線蟲自主運動能力明顯增強， 且呈劑量依賴性. 在第10天， 大多數(shù)線蟲均能自主運動， 但實驗組線蟲運動更活躍. 在第12天， 實驗組線蟲明顯具有較高的運動能力， A類和B類線蟲的比例較高， 對照組線蟲大多數(shù)為C類. 在第14天， 劑量依賴性對運動的影響更明顯， 對照組線蟲有79.4%為B類、 20.6%為C類， 實驗組線蟲大多數(shù)為A類或B類. 在第16天， 90.9%的對照組線蟲為C類， 而50%以上的實驗組線蟲仍為A類.

圖9 薄荷提取物對線蟲運動能力的影響

薄荷提取物對成年線蟲吞咽頻率的影響如圖10所示. 由圖10可見， 與對照組相比， 實驗組線蟲吞咽頻率明顯增加. 在第10，12，14天， 實驗組略高于對照組線蟲的吞咽頻率. 在第16天， 2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理組分別高于對照組線蟲吞咽頻率64%，88%，109%， 有明顯差異. 這些數(shù)據(jù)表明， 薄荷提取物可明顯提高成年線蟲的吞咽頻率.

圖10 薄荷提取物對線蟲吞咽能力的影響

2.7 薄荷提取物對實驗條件下線蟲壽命和育雛數(shù)的影響

薄荷提取物對實驗條件下線蟲壽命和育雛數(shù)的影響如圖11所示. 由圖11(A)可見， 對照組線蟲的平均壽命為(17.30±2.05)d (最長21 d). 用2.5，5，10 g/L薄荷提取物處理線蟲的平均壽命分別為(17.13±3.07)d(最長21 d)、 (17.29±3.05)d(最長22 d)和(16.65±2.08)d(最長21 d). 因此， 薄荷提取物對線蟲壽命無明顯影響. 由圖11(B)可見， 與對照組相比， 實驗組線蟲育雛數(shù)無明顯變化， 表明薄荷提取物不損害其生育能力.

圖11 實驗條件下薄荷提取物對線蟲壽命(A)和育雛數(shù)(B)的影響

綜上所述， 本文研究了薄荷提取物對線蟲抵抗多種應(yīng)激能力的影響， 并以紫外輻射為應(yīng)激源， 研究了薄荷提取物增強線蟲紫外輻射抵抗性的作用機制. 實驗結(jié)果表明： 薄荷提取物可減少線蟲體內(nèi)ROS積累并增強SOD活性； 薄荷提取物提高線蟲紫外輻射抵抗能力與胰島素/IGF-1樣信號通路有關(guān); 薄荷提取物增加了紫外輻射后DAF-16的細胞核定位和SOD-3表達量， 并增加了daf-16下游部分基因sod-3,hsp-12.6,hsp-16.1和hsp-16.49的mRNA水平表達量， 即薄荷提取物可通過DAF-16發(fā)揮抗紫外輻射作用; 薄荷提取物可改善線蟲肌肉功能， 增強成年線蟲的運動能力并增加其吞咽頻率， 且在實驗條件下， 薄荷提取物不損害線蟲壽命和生育能力.