木香烴內酯對體外培養大鼠骨髓間充質干細胞成骨性分化的影響

任 莉，李慧敏，高玉海，吳思敏，陳克明

由于人口結構的變化和預期壽命的延長，骨疾病尤其是骨質疏松癥變得越來越普遍。2016年中國60歲以上的老年人骨質疏松癥患病率達36%，說明骨質疏松癥已成為重要的公共衛生問題[1]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，能促進骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質等間充質組織的再生[2]。因此，如能有效促進BMSCs成骨性分化就有可能增加成骨細胞的數量和增強其活性，從而加速骨骼形成。而藥物可通過上述過程促進骨吸收，達到減緩骨質疏松的效果。木香烴內酯是從傳統中藥木香中提取的一種倍半萜內酯，研究發現其具有抗炎、抗真菌、抗癌等多種生物活性[3]。本實驗研究了木香烴內酯對大鼠BMSCs成骨性分化的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 木香烴內酯購自寶雞辰光有限公司，純度>98%。SPF級SD大鼠，甘肅省中醫學院動物實驗中心提供，合格證號SCXK(甘)2009-0006-152。

1.2實驗方法

1.2.1原代大鼠BMSCs分離培養：取80～120 g SD大鼠4只，原代大鼠BMSCs分離培養方法參考文獻[4-5]。脫頸處死大鼠后75%乙醇浸泡15 min，無菌條件下剝離出股骨和脛骨，剪去兩端骨骺，并用含10%胎牛血清的L-DMEM培養基完全沖出骨髓，直至骨髓腔變白，合并沖出液，反復吹打，使細胞團塊盡量打散。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養3 d，棄培養液，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2遍，換新鮮培養液繼續培養。此后每3天換液1次，待細胞鋪滿培養皿底80%～90%時行成骨性誘導培養,誘導條件為10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L L-抗壞血酸。

1.2.2成骨性誘導培養：原代細胞首次換液后用10-6mol/L木香烴內酯培養(木香烴內酯組)，對照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)木香烴內酯載體溶液，待細胞生長融合為80%～90%時行成骨性誘導培養，成骨誘導培養不同時間點檢測成骨性分化相關指標。

1.2.3堿性磷酸酶(ALP)活性測定：將傳至第3代的大鼠BMSCs接種于12孔板中，然后使用10-5～10-8mol/L木香烴內酯對大鼠BMSCs進行干預(每種濃度6孔)，同時設置對照組，待細胞生長融合為80%～90%時，加入成骨誘導劑行成骨性誘導培養。通常9 d后ALP活性達峰值，通過比較不同濃度木香烴內酯干預后ALP活性來確定木香烴內酯的最佳作用濃度。

1.2.4茜素紅染色：原代細胞以每孔2 ml接種于6孔板中，培養液中含10%胎牛血清。于成骨性誘導培養第12天，采用茜素紅染色法行鈣化結節組織化學染色。PBS液洗滌后，10%甲醛固定10 min。加入茜素紅染色劑，37℃孵育30 min，觀察鈣化結節的形成情況。

1.2.5BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達：BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和GAPDH引物由上海百賽公司設計并合成。于木香烴內酯干預24 h后，采用Trizol一步法提取總RNA，逆轉錄體系、PCR擴增體系及反應條件均參照說明書設定。RT-PCR數據采用ΔΔCt處理，實驗使用GAPDH為對照基因對數據進行處理，采用2-ΔΔCt表示結果，方法見文獻[6]。引物序列見表1。

表1 BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和GAPDH引物序列

1.2.6BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達：將原代大鼠BMSCs接種培養,首次換液后用木香烴內酯10-6mol/L培養(木香烴內酯組)，對照組加入等體積DMSO木香烴內酯載體溶液，待細胞生長融合為80%～90%時加入成骨性誘導劑行成骨性誘導培養，48 h后采用Western blot法檢測成骨活性相關蛋白表達。

2 結果

2.1BMSCs形態學觀察 鏡下觀察，培養初期大鼠BMSCs以梭形為主(圖1A，×10)，形成單細胞克隆(圖1B，×4)，隨著培養時間延長細胞體積增大(圖1C，×10)，誘導培養9 d左右出現鈣化結節(圖1D，×10)。

圖1 大鼠骨髓間充質干細胞形態學觀察

2.2木香烴內酯對大鼠BMSCs的最佳作用濃度 對照組ALP活性為31 U/gprot，10-5～10-8mol/L木香烴內酯干預大鼠BMSCs 9 d后，ALP活性分別為26、41、37、33 U/gprot。因此10-6mol/L為木香烴內酯對大鼠BMSCs的最佳作用濃度，后續實驗均采用此濃度。不同濃度木香烴內酯干預大鼠BMSCs 9 d后ALP活性見圖2。

圖2 不同濃度木香烴內酯干預大鼠骨髓間充質干細胞9 d后堿性磷酸酶活性變化情況

2.3茜素紅染色結果 BMSCs經木香烴內酯誘導培養12 d后行茜素紅染色，發現木香烴內酯組鈣化結節數目多于對照組(P<0.01)。茜素紅染色結果見圖3，鈣化結節陽性克隆統計結果見圖4。

圖4 大鼠骨髓間充質干細胞誘導培養12 d后鈣化結節陽性克隆統計

圖3 大鼠骨髓間充質干細胞誘導培養12 d后茜素紅染色

2.4木香烴內酯對BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達的影響 木香烴內酯組BMP-2、RUNX-2及CollagenⅠ mRNA表達水平均高于對照組(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

圖5 木香烴內酯干預大鼠骨髓間充質干細胞對BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達的影響

2.5木香烴內酯對BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達的影響 木香烴內酯干預大鼠BMSCs 48 h后采用Western blot法檢測成骨活性相關蛋白表達情況，木香烴內酯組BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達水平高于對照組。見圖6。

圖6 木香烴內酯干預大鼠骨髓間充質干細胞對BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達的影響

3 討論

研究發現，骨質疏松癥主要是由于骨代謝過程中骨形成和骨吸收失衡所致，BMSCs向成骨細胞分化的能力降低，進而導致骨形成減少[7]，而BMSCs具有多向分化潛能，可在不同微環境下定向誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經細胞等，具有良好的應用前景[8-10]。另有研究報道，云木香具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗真菌等多種生物活性[3]。抗腫瘤是木香烴內酯的主要藥理活性[11]。本研究以大鼠BMSCs為對象，用木香烴內酯進行干預，研究木香烴內酯對大鼠BMSCs的影響。結果顯示，10-6mol/L為木香烴內酯提高大鼠BMSCs成骨性分化的最佳作用濃度，而10-5mol/L的木香烴內酯可抑制ALP活性，說明木香烴內酯對BMSCs成骨性分化存在濃度依賴性。本實驗還經檢測ALP活性、鈣化結節染色和成骨活性相關蛋白、基因表達，明確木香烴內酯對大鼠BMSCs成骨性分化的影響。

BMSCs在骨修復過程中發揮重要作用[12]。木香烴內酯是中藥木香的主要有效成分，是一種倍半萜內酯類化合物。木香烴內酯分子結構中包含α-亞甲基-γ-內酯環，該結構能與含有巰基的酶及其功能性蛋白酶發生反應，進而干擾細胞的代謝過程，從而發揮多種藥理活性[13]。但目前關于木香烴內酯影響BMSCs成骨性分化的報道還較少。ALP是成骨細胞前體成骨性分化的重要標志物[14]，因此本文從ALP活性水平篩選木香烴內酯的最佳作用濃度，結果顯示不同濃度木香烴內酯作用BMSCs 9 d后，測定ALP活性發現，除10-5mol/L木香烴內酯對ALP活性產生抑制作用外，其余濃度(10-6、10-7、10-8mol/L)木香烴內酯干預大鼠BMSCs的ALP活性均高于對照組，且10-6mol/L木香烴內酯干預后的ALP活性最高。鈣化結節染色發現，相較對照組，木香烴內酯組BMSCs茜素紅染色鈣化結節陽性克隆更加密集，顏色也更深。這些結果表明，木香烴內酯能促進大鼠BMSCs成骨性分化。木香烴內酯組BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達顯著高于對照組；BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白是成骨細胞的標志蛋白，本實驗檢測BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達發現，木香烴內酯組BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達水平升高，說明木香烴內酯可促進大鼠BMSCs向成骨細胞分化。

綜上，木香烴內酯能誘導大鼠BMSCs向成骨細胞分化，且濃度為10-6mol/L時誘導作用最強。