血小板參數(shù)和血小板聚集功能檢測對(duì)2型糖尿病治療后監(jiān)測的臨床價(jià)值探討*

趙 玲，楊伏猛，婁煥堃，劉婷婷，馬 芳，梁 偉△

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院,安徽蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇連云港 222000；3.江蘇省連云港市東海縣人民醫(yī)院口腔科，江蘇連云港 222300

隨著人們生活水平的提高和人口老齡化的到來，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后發(fā)病率居世界第3位的慢性病，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。研究表明，90%以上的糖尿病患者主要死于心腦血管疾病并發(fā)癥，而心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與血小板高活性狀態(tài)密切相關(guān)[1]。研究表明，2型糖尿病(T2DM)患者的血小板處于高活性狀態(tài)，因此，早期預(yù)防和治療是阻止T2DM心腦血管疾病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[2]。本研究旨在探討血小板參數(shù)、血小板聚集功能及血小板P-選擇素和磷脂酰絲氨酸(PS)外翻檢測對(duì)T2DM患者治療后監(jiān)測中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年4—9月于蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科進(jìn)行住院治療的非初診T2DM患者60例納入治療組。選取同期蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診確診、初發(fā)、未經(jīng)治療的T2DM患者60例納入初發(fā)組。選取同期排除T2DM的健康體檢者60例納入對(duì)照組。所有確診患者均符合2016年美國糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo)準(zhǔn)。3組研究對(duì)象的年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性創(chuàng)傷或急慢性感染患者；(2)原發(fā)或其他繼發(fā)性腎臟疾病患者；(3)急慢性心、肝、肺、腎、心腦血管、消化道疾病患者；(4)惡性腫瘤、自身免疫性疾病患者；(5)采集血液標(biāo)本前2周未使用過抗血小板藥物或抗凝藥物。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板分布寬度(PDW)、血小板平均體積(MPV)的檢測采用Sysmex XN-1000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其配套試劑(日本希森美康公司生產(chǎn))；分別應(yīng)用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和膠原(COL)作為血小板誘導(dǎo)劑，使用LBY-NJ4A血小板聚集儀(北京泰利康信公司生產(chǎn))檢測各組研究對(duì)象的血小板最大聚集率(PAgTm)，AA、ADP及COL所對(duì)應(yīng)的試劑批號(hào)分別為20200427A、20200425B、20200424C，嚴(yán)格按照儀器標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程進(jìn)行操作。流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測血小板P-選擇素表達(dá)和PS外翻，試劑分別采用FITC標(biāo)記的抗P-選擇素單克隆抗體和APC標(biāo)記的Annexin V。

表1 3組研究對(duì)象一般資料比較

1.3標(biāo)本采集 (1)采集空腹靜脈血2 mL，采用15%乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，進(jìn)行血小板參數(shù)檢測；(2)采集空腹靜脈血3 mL，采用109mmol/L的枸櫞酸鈉以1∶9比例進(jìn)行抗凝，采血完畢后及時(shí)混勻，避免使用溶血、脂血和乳糜血的標(biāo)本，將采血管在160×g的離心力下離心10 min，分離富血小板血漿(PRP)；然后繼續(xù)在2 000×g的離心力下離心10 min，分離乏血小板血漿(PPP)，PRP與PPP制備完成后分別以AA、ADP及COL作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用LBY-NJ4A血小板聚集儀來檢測每例研究對(duì)象第300秒所對(duì)應(yīng)的PAgTm。所有檢測指標(biāo)均要求4 h內(nèi)完成。(3)制備洗滌血小板。取健康體檢者或糖尿病患者靜脈血與ACD(2.5%枸櫞酸鈉、2.0%葡萄糖、1.5%枸櫞酸)按照1∶7比例抗凝，1 300 r/min離心20 min得到PRP，PRP經(jīng)2 500 r/min離心20 min，沉淀用CGS緩沖液懸浮，經(jīng)離心、洗滌，最后用MTB液重懸，得到洗滌血小板，調(diào)整血小板計(jì)數(shù)為3×108/mL，室溫靜置1～2 h使其恢復(fù)至靜息狀態(tài)以備用。

1.4檢測方法 (1)PLT、PCT、PDW、MPV采用電阻抗法在全自動(dòng)血液分析儀上檢測；PAgTm采用光電比濁法檢測。所有標(biāo)本檢測前，儀器均經(jīng)過維護(hù)和校準(zhǔn)，且室內(nèi)質(zhì)控符合要求方可實(shí)施檢測。(2)流式細(xì)胞儀檢測PS外翻：3 ×108/mL洗滌血小板50 μL加入250 μL 1 × Annexin V結(jié)合緩沖液和10 μL FITC標(biāo)記的Annexin V，在避光、震蕩條件下室溫孵育20 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，并記錄Annexin V陽性細(xì)胞百分比。(3)流式細(xì)胞儀檢測血小板P-選擇素表達(dá)：3× 108/mL洗滌血小板50 μL加0.25 μL FITC標(biāo)記的抗P-選擇素單克隆抗體，室溫孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.13組間血小板參數(shù)及PAgTm比較 治療組MPV明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而PCT、PDW、PLT、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm在兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初發(fā)組MPV、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm明顯高于對(duì)照組和治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而PCT、PDW、PLT在3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.23組間血小板P-選擇素表達(dá)和PS外翻比較 對(duì)照組與治療組PS外翻和血小板P-選擇素表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而初發(fā)組與其他兩組間的PS外翻和血小板P-選擇素表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)T2DM的輔助診斷價(jià)值 繪制MPV、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm、血小板P-選擇素及PS外翻輔助診斷T2DM的ROC曲線，且分別計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的ROC曲線下面積、cut-off值、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值，見表3。

表2 3組間血小板參數(shù)及PAgTm等指標(biāo)比較

組別nAA-PAgTm(max,%)ADP-PAgTm(max,%)COL-PAgTm(max,%)血小板P-選擇素(%)PS外翻(%)對(duì)照組6063.58±8.2765.27±8.5765.87±9.448.32±1.988.68±2.02治療組6064.07±7.4165.95±8.0067.78±8.158.45±0.929.28±0.82初發(fā)組6075.87±4.01*#75.58±5.30*#76.93±6.43*#10.88±1.02*#11.38±1.56*#F62.4736.1831.9863.9352.61P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

表3 各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)T2DM的輔助診斷性能比較

3 討 論

血小板主要來源于骨髓成熟的巨核細(xì)胞，PLT及MPV反映了骨髓中巨核細(xì)胞的增生、代謝及血小板生成情況[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MPV與血小板活性呈正相關(guān)[4]，可能是因?yàn)樾律傻难“弩w積較大，含較多致密體，能夠釋出多種內(nèi)容物，故具有更高的功能活性。范志佳等[5]也綜述了糖尿病患者的大截面血小板是細(xì)胞器豐富的大體積血小板，是糖尿病患者血小板高功能活性的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組與初發(fā)組患者的MPV均明顯高于對(duì)照組，這與已有的大量研究結(jié)果一致[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組的PLT與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，本研究結(jié)果與李金密等[6]的研究結(jié)論一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者的PLT較健康對(duì)照者明顯升高[7]。此外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，T2DM患者PLT較健康對(duì)照者明顯下降[8]。截至目前，關(guān)于糖尿病是否會(huì)引起PLT的變化及如何變化，尚存在爭議。

本研究結(jié)果顯示，各組間PCT無明顯差異，這與趙志勇等[4]的研究結(jié)果一致。也有研究者認(rèn)為PCT在糖尿病患者中明顯升高，且隨糖尿病嚴(yán)重程度增加而升高[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的PDW較健康對(duì)照者明顯升高[10-11]，可能與MPV升高引起PDW升高有關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)，治療組與對(duì)照組PDW并無明顯差異，分析其原因，這都是單中心的研究結(jié)論，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量實(shí)施多中心研究來確認(rèn)PDW與T2DM的相關(guān)性。

有研究發(fā)現(xiàn)，MPV較大的血小板對(duì)誘導(dǎo)劑的聚集反應(yīng)性也相應(yīng)增強(qiáng)，更易促進(jìn)血栓形成，使糖尿病患者發(fā)生微血管病變的危險(xiǎn)性增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組的PAgTm明顯低于初發(fā)組，表明糖尿病患者經(jīng)過規(guī)范化治療后，可引起血小板聚集功能的下降，而血小板高聚集功能與糖尿病患者心腦血管并發(fā)癥密切相關(guān)[13]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)組血小板P-選擇素和PS外翻的水平高于治療組和對(duì)照組，而治療組和對(duì)照組之間差異并不明顯，說明未經(jīng)治療的T2DM患者體內(nèi)血小板的活化和凋亡增加，此結(jié)果表明血小板P-選擇素和PS外翻可作為初發(fā)糖尿病患者的輔助診斷指標(biāo)之一，提示早期規(guī)范化降糖治療可降低糖尿病患者血小板的聚集活性。因此，及早對(duì)糖尿病患者進(jìn)行規(guī)范化治療對(duì)延緩心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展十分重要，目前臨床對(duì)糖尿病患者心腦血管并發(fā)癥的監(jiān)測手段匱乏，本研究發(fā)現(xiàn)MPV、PAgTm、血小板P選擇素和PS外翻可以作為T2DM患者是否被規(guī)范治療的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估指標(biāo)，其中，血小板P-選擇素用來輔助診斷T2DM的靈敏度最高(88.3%)，COL-PAgTm的特異度最佳(91.7%)，而AA-PagTm的診斷效率最優(yōu)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MPV、PAgTm、血小板P-選擇素和PS外翻在初發(fā)未經(jīng)治療的T2DM中明顯升高，經(jīng)規(guī)范治療后可明顯降低血小板的活化水平，這些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)可以輔助T2DM的診治，為糖尿病患者心腦血管并發(fā)癥的防控提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支撐，值得在臨床上推廣。