Nrf2基因多態性與維吾爾族人群COPD的相關性*

李 黎，唐李鳳，鐘雪梅，任 杰，張素杰，何川疆，鄒小廣△，許愛敏▲

1.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆喀什 844000；2.石河子大學，新疆石河子 832000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種可防、可治的常見病[1]。我國COPD的疾病負擔重，患病率呈逐年上升趨勢[2]。COPD病因和發病機制復雜，受環境和遺傳因素共同影響[3]。目前，研究結果表明COPD的分子發病機制主要是氣道炎性反應，且氧化應激可促使炎性反應相關基因表達[4]。Nrf2的激活是機體抵抗氧化應激的關鍵，它可調節多個抗氧化酶來保護細胞免受氧化損傷[5]。近年來研究發現，Nrf2啟動子區域的多態性與COPD易感性有關，圍繞Nrf2遺傳變異的研究可能開辟未來治療COPD的重要途徑[6]，然而，關于Nrf2基因多態性與維吾爾族人群COPD的相關性研究報道較少。本研究旨在評估Nrf2基因位點rs35652124、rs6721961單核苷酸多態性(SNP)與維吾爾族人群COPD易感性的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月在新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院接受治療的203例COPD患者作為病例組，COPD的診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診斷、治療與預防全球倡議》(GOLD)標準[1]。同期選擇新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院199例維吾爾族體檢健康者作為對照組，均滿足以下條件:(1)胸部CT檢查結果顯示無器質性病變；(2)肺功能正常，第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1% Pred)>80%，吸入400 μg沙丁胺醇30 min后第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比(FEV1/FVC)>70%。所有研究對象均符合以下標準：(1)排除與氧化應激有關的疾病，如支氣管擴張、肺結核、肺間質纖維化、結節病、支氣管哮喘、糖尿病、心臟病等；(2)排除有各系統腫瘤病史；(3)均為維吾爾族，至少3代長期居住于喀什地區，各研究對象之間無任何血緣關系，且無外族通婚史。本研究通過新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血，使用Greiner 基因組DNA提取試劑盒(德國，Greiner)按照說明書步驟從全血標本中提取DNA。

1.2.2SNP選擇 使用Sequenom公司Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design軟件設計待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，并送至中國上海天昊生物技術有限公司進行PCR擴增，引物序列見表1。

1.2.3基因檢測 采用多重PCR技術，在以下反應條件下擴增所選位點的基因序列：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循環40次，最后72 ℃延伸3 min；然后將擴增產物用蝦堿性磷酸酶處理以除去反應中的dNTPs，再經過單堿基延伸引物(約20 bp)擴增SNP位點及樹脂純化，最后采用Sequenom-MassARRAY SNP技術進行SNP分型檢測[7]。

表1 Nrf2基因多態性位點引物序列

2 結 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對兩組研究對象中所檢測到的Nrf2基因多態性位點(rs6721961、rs35652124)的基因型分布頻率進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示這兩個位點的基因分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2病例組與對照組基線資料比較 病例組與對照組在性別、BMI、吸煙、動物粉塵暴露方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。兩組間年齡、SI、FEV1%Pred、用力肺活量占預計值百分比(FVC%Pred)比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3兩組Nrf2基因多態位點的基因型及等位基因分布頻率比較 病例組與對照組rs6721961(G/T)、rs35652124(C/T)的基因型和等位基因分布頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組的基線資料比較

表3 兩組Nrf2基因多態位點的基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

基因位點nrs6721961GGGTTTGT對照組199105(52.8)86(43.2)8(4.0)296(74.4)102(25.6)病例組203124 (61.1)71(35.0)8(3.9)319(78.6)87(21.4)χ2-2.9680.104-1.971OR(95%CI)-0.699(0.465～1.051)0.847(0.307～2.334)-0.791(0.571～1.097)P-0.0850.748-0.160

2.4多因素Logistic回歸分析 在校正性別、年齡、吸煙等混雜因素后，結果顯示rs35652124、rs6721961位點的基因型和等位基因分布頻率與COPD的關系差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析

續表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

氧化應激損傷和抗氧化防御機制在COPD的發生、發展中起著重要作用，Nrf2是維持肺組織增生和存活最重要的抗氧化分子之一[8]。在氧化應激狀態下，位于細胞質的Nrf2分子轉移至細胞核內與抗氧化反應元件(ARE)結合，促進抗氧化劑基因表達[9]，進而發揮穩定抗氧化作用。近年來研究發現，Nrf2 表達下調可能是COPD發病的重要原因之一，激活Nrf2表達可能是未來治療COPD的重要途徑[10]。

SNP是人類遺傳變異最常見的來源，當關鍵區域突變時可能會影響基因功能。近年來，國內外已開展多項關于Nrf2啟動子區域SNP與COPD易感性的研究。例如，美國學者研究發現，Nrf2啟動子區域的rs6721961(C/C)與極低出生體質量(VLBW)新生兒重度支氣管肺發育不良(BPD)風險降低有關[11]，而事實上幼年時期肺發育不良是COPD的重要危險因素之一[12]。此前，國內針對內蒙古地區蒙古族人群的研究發現，rs6721961位點與COPD遺傳易感性不相關[13]。但周小果[14]的研究卻發現，rs6721961(C/A)的A等位基因頻率是我國漢族COPD的危險因素。此外，Nrf2啟動子區域的rs35652124位點也顯示出與氧化應激性疾病風險的相關性，俄羅斯最近的一項研究發現，rs35652124位點SNP是吸煙人群COPD的危險因素，該位點AA基因型與FEV1明顯相關[15]。有趣的是，本研究證實Nrf2啟動子區基因位點rs35652124(C/T)、rs6721961(G/T)SNP與COPD的關系差異無統計學意義(P>0.05)。本研究強調了不同人群COPD易感性的遺傳異質性。

本研究是首次在維吾爾族人群中進行Nrf2基因多態性與COPD相關性的研究，由于樣本地理來源的局限性，研究結果僅表明這兩個基因位點在喀什地區維吾爾族人群中存在差異。但由于本研究樣本有限，結果可能存在偏差。鑒于本研究得到的陰性結果，未來的研究將增加樣本量以充分了解更多的遺傳異質性。

綜上所述，本研究顯示Nrf2啟動子區基因位點rs35652124和rs6721961SNP與維吾爾族人群COPD發病無關，表明遺傳與環境等因素共同影響著COPD的發生、發展，基因多態性與疾病的相關性因地域或種族不同而存在一定差異，有待進一步深入研究。