生物信息學在篩選影響結直腸癌預后基因中的應用*

伏小紅,馮宦翔,茍 偉,楊 敏,郭 靚,屈春燕

四川省成都市第七人民醫院:1.檢驗科；2.神經內科，四川成都 610000

結直腸癌(CRC)的發病率和病死率在消化系統惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發性肝癌[1]，近年來其發病率在我國不少地區有不斷上升的趨勢[2]。有研究發現，普遍的篩查可有效提升CRC患者的生存率，降低其病死率[3]。鑒于篩查的現實需要和目前篩查方式的不足，急需尋找更方便快捷的篩查方法。基因芯片和基因圖譜是一種很成熟的檢測技術，特別適用于篩選差異表達基因(DEGs)[4]。運用生物信息學方法整合和分析基因芯片應用過程中積累下來的大量CRC數據，并與表達譜技術相結合，非常適用于研究CRC可能存在的生物標記物基因。本研究結合多種數據庫開展CRC的研究。

1 資料與方法

1.1篩查出有差異的上調和下調基因 從基因芯片數據庫(NCBI-GEO)中獲取GSE110224、GSE41328和GSE15960基因在CRC組織及正常結直腸組織中的表達譜，均是GPL570[G-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，包括28個正常結直腸組織標本和38個CRC組織標本；采用GEO2R在線工具對CRC組織標本和正常結直腸組織標本的DEGs數據進行分析(|logFC|>2和調整P<0.05)；然后再用Venn軟件對原始數據進行分析，檢測3個基因芯片之間的差異，logFC<0的DEGs為下調基因，logFC>0的DEGs為上調基因。

1.2分析篩選出的DEGs的生物學特征 在DAVID數據庫里，用基因本體論(GO)分析篩選出的DEGs的生物學特征，分成生物過程(BP)組、分子功能(MF)組和細胞成分(CC)組3組。用京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析信號通路情況。

1.3分析蛋白質相互作用 通過檢索相互作用基因的搜索工具(STRING)分析蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡，再用MCODE插件進一步分析。

1.4分析篩選出的DEGs對生存率的影響及對RNA的表達 利用UALCAN數據庫評估篩選出的基因對生存率的影響，計算出有95%置信區間的logrankP值和風險比(HR)。利用基因表達數據交互分析(GEPIA)網站對標本的RNA表達數據進行分析。

2 結 果

2.1CRC的DEGs分析 用于鑒別的DEGs共包括38份CRC組織標本和28份正常結直腸組織標本。通過GEO2R在線工具，分別從GSE110224、GSE41328和GSE15960中提取出177、290和3 235個DEGs。用Venn軟件對3個數據集中的常用數據集進行識別，共檢測到62個常見DEGs(21個上調基因，41個下調基因)。見表1、圖1。

2.2DEGs的GO和KEGG通路分析 在DAVID數據庫里采用GO分析篩選出的62個DEGs，KEGG通路分析表明，下調的DEGs在腎素分泌和胰腺分泌調節信號通路富集，主要相關的基因是CLCA1和CLCA4，而上調的DEGs未見明顯的信號通路(P<0.05)，見表2、3。

2.3PPI和MCODE插件分析 PPI分析36個DEGs被導入到含有59個節點和60條變的DEGs PPI網絡復合體中，62個DEGs中有36個被納入到DEGs PPI網絡，其中包括10個上調基因和26個下調基因。采用MCODE插件進一步分析結果顯示，6個中心節點均為下調基因，見圖2。

表1 CRC組織與正常結直腸組織相比得出的3個基因芯片都包含的21個上調基因和41個下調基因

注：A為上調基因；B為下調基因；數據為DEGs。

2.4UALCAN和GEPIA的核心基因分析 CRC基因表達數據來源于數據庫中的結腸腺癌(COAD)和直腸腺癌(READ)兩種癌癥所表達的數據。利用UALCAN數據庫對6個核心基因對CRC的預后影響進行分析，發現CLCA1和CLCA4基因低表達時對COAD的預后有明顯影響(P<0.05)，對READ無明顯影響，且剩余4個基因差異無統計學意義(P>0.05)。用GEPIA對核心基因再進行分析發現，CRC組織與正常結直腸組織相比，CLCA1和CLCA4基因在CRC中表達明顯降低(P<0.05)。見圖3、4。

2.5KEGG通路富集分析 通過DAVID數據庫重新對這3個篩選出的基因進行KEGG通路富集分析，結果顯示只有CLCA4在腎素分泌的通路中明顯表達降低(P<0.05)。

表2 CRC的DEGs的KEGG通路分析

注： A為STRING分析PPI結果；B為MCODE分析所得中心節點。

注：A為CLCA1基因；B為CLCA4基因;*P<0.05。

表3 CRC的DEGs的GO分析

續表3 CRC的DEGs的GO分析

注：A為CLCA1的表達水平對COAD患者生存率的影響；B為CLCA4的表達水平對COAD患者生存率的影響。

3 討 論

CRC作為全球癌癥相關死亡的第4大原因，在CRC不同發展階段診斷的患者5年生存率差異很大，早期診斷的患者生存率超過70%，而晚期診斷的患者生存率不到10%[5]。超過一半的CRC患者在診斷時已有局部和遠處轉移，尤其是淋巴結轉移嚴重影響患者的預后[6]。并且有研究發現越年輕的CRC患者預后也越好[7]，因此如果有便捷的早期篩查方法在常規體檢或者是轉移發生前及早地發現CRC，能夠有效提高CRC的生存率。

本研究利用生物信息學方法對3個芯片進行了深入分析，集中研究了多個基因，與正常結直腸組織相比，CRC組織中的CLCA1和 CLCA4存在明顯差異，同時發現這兩個基因的低表達能夠對COAD患者的生存率產生影響，這一發現提示CLCA1和 CLCA4可能是診斷和治療CRC的潛在生物標志物。但CLCA1和 CLCA4的低表達通過GEPIA分析只對COAD的預后有明顯影響，而在READ組織中的明顯低表達卻未對其預后有明顯影響，這可能與數據庫的標本收入量等有關，還需進一步做更深入的研究。

CLCA1和CLCA4是鈣活化氯離子通道家族中的成員，與CLCA2一起具有相似的一級結構。鈣活化氯離子通道調控因子作為一種在氨基酸末端中具有對稱多半胱氨酸基序的蛋白質[8]，在多種癌癥中都出現表達失調[9-10]。同時，對鈣活化氯離子通道蛋白的研究發現，其不僅可以調節炎性反應，還參與致癌[11]，由于其相似的一級結構，使其可能在作用效能上也存在類似情況。

有研究發現，CRC患者的CLCA1血清水平較健康對照者明顯降低，并且CLCA1血清水平和CLCA1mRNA表達水平與CRC的轉移和分期呈負相關，還發現CLCA1可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路和上皮細胞-間質轉化(EMT)發揮抑癌作用[12]。異常的Wnt信號可以觸發EMT過程，這在癌癥轉移中至關重要。CLCA1表達的增加降低了β-catenin的表達水平，抑制了EMT從而抑制腫瘤的活性，這與一些文章發現的Wnt/β-catenin激活和炎癥性腸病是導致CRC的兩個主要因素的結論不謀而合，這兩個因素能導致腸道內腸上皮內環境穩態的破壞，如細胞增殖增加、細胞分化和凋亡減少等[13-15]。同時，EMT過程使上皮細胞轉化為間質細胞，使細胞失去黏附和極性，從而發生遷移和侵襲[16]。

對于CLCA4，近期也有研究指出，CLCA4在細胞中發揮生物學功能是通過使PI3K/AKT信號失活和調節EMT介導的，并且CLCA4 的降低與CRC患者的淋巴結轉移有關[17]，這與LIU等[18]發現的CLCA4抑制肝癌細胞的增殖和侵襲的機制相似。

綜上所述，應用生物信息學分析方法，本研究篩選出了CLCA1和CLCA4兩個基因，對其進行更進一步的作用機制討論，發現它們嚴重影響CRC的轉移，且最終影響CRC患者的預后。本研究豐富了CLCA1和CLCA4在CRC中的認識，二者有可能可以作為CRC的診斷依據和治療靶點。