牛肉低溫儲(chǔ)藏過程中水分遷移與蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性研究

孫慧琳，代媛媛，孟蘭奇，查恩輝

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

牛肉中富含的蛋白質(zhì)、氨基酸有修復(fù)組織以及提高機(jī)體抗病能力等功效。我國(guó)作為牛肉和牛肉制品的第三消費(fèi)大國(guó)，近年來(lái)生產(chǎn)和銷售量逐漸升高。儲(chǔ)藏品質(zhì)一直是牛肉屠宰企業(yè)及生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的問題，儲(chǔ)藏溫度不同，品質(zhì)差異較大。冷藏是肉類目前最簡(jiǎn)單易行和最經(jīng)濟(jì)的儲(chǔ)藏方式，冰溫儲(chǔ)藏消除了冰晶對(duì)食品的不良影響，包括蛋白變性以及凍害等危害，滿足消費(fèi)者對(duì)綠色、方便、具有較長(zhǎng)貨架期的冷鮮肉的需求。而影響牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)就包含蛋白質(zhì)氧化以及水相的變化，劉澤龍[1]通過Fenton氧化體系對(duì)蛋白進(jìn)行氧化，研究發(fā)現(xiàn)，肌肉的蛋白質(zhì)氧化會(huì)影響其水合與持水能力。

蛋白質(zhì)氧化會(huì)影響肉品的加工特性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及風(fēng)味滋味，對(duì)肉制品品質(zhì)影響極大。蛋白質(zhì)氧化被定義為一種共價(jià)鍵修飾，能夠造成蛋白質(zhì)多肽鏈的斷裂、氨基酸側(cè)鏈被修飾以及蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)聚合等一系列破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，從而改變蛋白質(zhì)乳化、溶解、起泡、凝膠等特性[2-3]，影響肉品品質(zhì)。扶慶權(quán)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)氧化的程度加劇，肌細(xì)胞外圍的羰基氧化熒光信號(hào)顯著增加，表明羰基含量增加。Lund等[5]研究發(fā)現(xiàn)，一些自由基誘導(dǎo)物例如羥自由基（·OH）、過氧化自由基（HO2·）等和一些非自由基誘導(dǎo)物例如過氧化氫（H2O2）、次氯酸（HClO）和臭氧等均可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，且在不同儲(chǔ)藏條件下豬肉的肌球蛋白重鏈發(fā)生不同程度降解，造成總巰基含量顯著下降。

通過核磁共振（NMR）技術(shù)研究牛肉中水的遷移規(guī)律和分布狀態(tài)，弛豫時(shí)間T2可以靈敏地區(qū)分多種相態(tài)的氫質(zhì)子，并且能夠反映牛肉內(nèi)部氫質(zhì)子所處環(huán)境以及氫質(zhì)子所受的束縛力和自由度[6]。牛肉中存在3種水分狀態(tài)，其含量的變化會(huì)對(duì)牛肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響，一般分為強(qiáng)結(jié)合水T2b（0.1～1 ms），弱結(jié)合水T21（1～10 ms），不易流動(dòng)水T22（10～100 ms），自由水T23（100～1 000 ms）。Margit等[7]通過低場(chǎng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)鮮肉在冷凍儲(chǔ)藏時(shí)的水相變化，研究發(fā)現(xiàn)，凍藏的時(shí)間及溫度與肉樣的持水性呈顯著相關(guān)，凍藏的溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)，水分損失就越嚴(yán)重。戚軍等[8]通過低場(chǎng)核磁共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)羊肉經(jīng)反復(fù)凍融后其保水性顯著下降。

目前，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用核磁共振技術(shù)檢測(cè)牛肉品質(zhì)，針對(duì)牛肉的水分遷移及蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性略有研究。本文利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)研究牛肉在不同儲(chǔ)藏溫度下水分遷移與蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性，目的是找到能夠快速表征蛋白質(zhì)氧化程度的檢測(cè)方法，為牛肉儲(chǔ)藏過程中的無(wú)損檢測(cè)提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

牛背最長(zhǎng)肌，購(gòu)于錦州鮮肉批發(fā)市場(chǎng)。三氯乙酸、鹽酸乙醇、氧化鎂、氯化鈉（分析純（AR）），購(gòu)于珠海麗珠試劑股份有限公司；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸鈉（均為AR），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；五水合硫酸銅、磷酸二氫鈉、四水合酒石酸鉀鈉、EDTA、DTNB（均為AR），購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司；鹽酸胍、DNPH、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）、牛血清蛋白（均為AR），購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BCD-258WLDPN冰箱，購(gòu)于漢莎科學(xué)儀器有限公司；JJ5000A電子天平，購(gòu)于華瑞科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，購(gòu)于上海譜元儀器有限公司；NMI20核磁共振成像儀，購(gòu)于上海紐邁科技有限公司；JIDI-16D高速離心機(jī)，購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

選取宰后24 h內(nèi)的牛背最長(zhǎng)肌，去除筋膜后沿肌原纖維方向切成10 g左右肉塊，使用PE保鮮膜包裝后分別放置于避光的4℃冷藏室及-2℃冰溫室，于包裝后0、2、4、6、8、10 d取樣測(cè)定各指標(biāo)。

1.2.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 肌原纖維蛋白的提取

將牛肉剔除脂肪后切碎，稱取10.0 g肉樣加入隔離緩沖溶液，冰浴條件下勻漿30 s。勻漿后離心15 min（5 000 r/min），棄掉上層清液。重復(fù)上述步驟兩次。將得到的肌原纖維顆粒用0.1 mol/L氯化鈉洗提3次，在最后1次離心前用4層紗布過濾，用0.1 mol/L的鹽酸將pH調(diào)到6.0[9]。得到的沉淀為肌原纖維蛋白，密閉后置于冰上保藏，在24 h內(nèi)用完。

1.2.2.2 蛋白含量的測(cè)定

將牛血清蛋白配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加水至1 mL，加入雙縮脲試劑至5 mL，渦旋后室溫靜置20 min，于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光度，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值[10]。經(jīng)計(jì)算，回歸方程y=0.049 1x+0.004 2，R2=0.999 7。

1.2.2.3 羰基含量的測(cè)定

將肌原纖維蛋白用0.1 mol/L的磷酸緩沖液稀釋為2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，取1 mL肌原纖維蛋白質(zhì)溶液，加入1 mL DNPH溶液，空白對(duì)照則加入1 mL 2 mol/L鹽酸溶液，在室溫下暗室靜置1 h。加入1 mL TCA溶液，離心5 min（13 000 r/min），收集沉淀，用體積比為1∶1的乙酸乙酯-乙醇混合溶液充分洗滌并離心3次，去除殘留的試劑。溶劑揮發(fā)后，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，38℃下水浴15 min后離心5 min（13 000 r/min），取上清液于370 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光度[11]。采用摩爾消光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)計(jì)算羰基含量。

式中：A370為370 nm下的吸光度；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C為測(cè)得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.2.4 巰基含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0.5 mL肌原纖維蛋白質(zhì)溶液放入玻璃試管中，而空白對(duì)照則加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，然后加入2.0 mL尿素-SDS溶液、0.5 mL DTNB試劑。渦旋后暗室靜置10 min，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度[12]。使用摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)來(lái)計(jì)算蛋白中總巰基含量。

式中：A412為412 nm下的吸光度；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C為測(cè)得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.3 pH的測(cè)定

將肉樣切成肉糜，稱取5.0 g，放入盛有45 mL蒸餾水的錐形瓶中，混勻后振蕩30 min，之后用pH計(jì)測(cè)定。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 儲(chǔ)藏?fù)p失率的測(cè)定

稱量?jī)?chǔ)藏前肉樣質(zhì)量（m1），分別進(jìn)行冷藏、凍藏，到期取出肉樣后，于室溫下解凍，用濾紙吸凈多余水分后稱重（m2），計(jì)算儲(chǔ)藏?fù)p失率。

1.2.5 水相遷移的測(cè)定

將2組肉樣分別分割為1.0 g，體積約為10 mm×10 mm×20 mm后放入直徑為15 mm、長(zhǎng)為200 mm的低場(chǎng)核磁專用管內(nèi)，排除內(nèi)部空氣后用保鮮膜封閉包裝。將核磁管放入低場(chǎng)核磁共振儀中檢測(cè)。磁體溫度為32℃，質(zhì)子共振頻率為21 MHz[13]。選擇CPMG脈沖序列，參數(shù)設(shè)定為：SF1=22 MHz、O1=911.887 4 kHz、P1=15μs、P2=30μs、τ=150μs、TD=90 016、Echo Cnt=3 000、NS=8、TR=1 000、RG1=30、RG2=3。每組樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)，每個(gè)平行重復(fù)測(cè)定3次。用Multi Exp Inv Analysis軟件進(jìn)行CPMG指數(shù)衰減曲線反演。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2017分析pH、儲(chǔ)藏?fù)p失率等指標(biāo)的平均值和變化規(guī)律，繪制折線圖，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。數(shù)據(jù)處理用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析NMR與羰基、巰基的相關(guān)性，顯著水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)藏期間牛肉蛋白羰基及巰基含量的變化

肌肉中所含的賴氨酸、脯氨酸等能被直接氧化形成羰基；烷氧自由基（CO·）與烷基過氧化物（COOH）通過α-酰胺化途徑導(dǎo)致多肽骨架鏈β-斷裂；賴氨酸易與還原糖反應(yīng)生成羰基衍生物[14]，三種方式均可使羰基含量增多，所以可以通過測(cè)量羰基來(lái)衡量蛋白質(zhì)氧化程度。儲(chǔ)藏期間牛肉蛋白質(zhì)中羰基的含量變化如圖1所示。由圖1可知，新鮮牛肉的羰基含量為0.62 nmol/mg Prot，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，冷藏組和冰溫組蛋白的羰基含量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，但氧化速度冷藏組大于冰溫組。儲(chǔ)藏至10 d時(shí)，冷藏組及冰溫組的羰基含量分別為1.29 nmol/mg Prot和0.98 nmol/mg Prot。李茜[15]研究發(fā)現(xiàn)，托盤包裝的牛肉冷藏10 d，羰基含量由1.35 nmol/mg Prot增長(zhǎng)到2.60 nmol/mg Prot，冰溫儲(chǔ)藏10 d羰基含量由1.35 nmol/mg Prot增長(zhǎng)到1.50 nmol/mg Prot。結(jié)果表明冷藏條件儲(chǔ)藏的牛肉其羰基含量增加程度大于冰溫儲(chǔ)藏條件，該結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

圖1 不同儲(chǔ)藏溫度下牛肉蛋白質(zhì)羰基含量的變化Fig.1 Changes of beef carbonyl contents at different storage temperatures

蛋白質(zhì)分子中的蛋氨酸含有的硫原子易被氧化生成二硫鍵導(dǎo)致巰基含量降低；半胱氨酸被氧化成磺酸、亞磺酸、次磺酸，蛋氨酸被氧化成亞砜和砜[16]，也可導(dǎo)致巰基含量降低，所以可以通過測(cè)量巰基含量來(lái)衡量蛋白質(zhì)氧化程度。儲(chǔ)藏期間，牛肉蛋白質(zhì)中巰基含量變化如圖2所示。新鮮牛肉的巰基含量為79.92 nmol/mg Prot，在儲(chǔ)藏過程中巰基含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。冰溫組在儲(chǔ)藏過程中巰基變化較為平穩(wěn)，在儲(chǔ)藏10 d后降為73.71 nmol/mg Prot，巰基含量損失約7%；冷藏組的巰基含量在儲(chǔ)藏前期（0～6 d）變化不大，表明在儲(chǔ)藏前期冷藏條件下的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，儲(chǔ)藏6 d之后，冷藏組巰基含量下降趨勢(shì)增大，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)劇烈變化，最終在10 d時(shí)降為70.73 nmol/mg Prot，巰基含量損失約11%。

2.2 儲(chǔ)藏期間牛肉pH的變化

儲(chǔ)藏期間牛肉pH的變化如圖3所示。牛肉的pH在儲(chǔ)藏前期（0～2 d）呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，是由于新鮮牛肉排酸不徹底，尸僵未結(jié)束，乳酸持續(xù)積累導(dǎo)致牛肉在儲(chǔ)藏前48 h pH下降，48 h后出現(xiàn)自身解僵，pH上升。在冷藏4 d條件下pH上升是由于隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸逐漸被降解且牛肉表面的微生物活動(dòng)加快，并在酶的作用下使蛋白質(zhì)分解為氨、氨基酸等堿性物質(zhì)[17]，從而使得牛肉pH上升。當(dāng)肉類pH＞6.7即為變質(zhì)，冷藏10 d的牛肉pH已達(dá)到6.78，此時(shí)牛肉已腐敗變質(zhì)，蛋白質(zhì)不斷被分解生成的堿性物質(zhì)使pH增大。冰溫儲(chǔ)藏牛肉在0～4 d時(shí)pH下降，在4～10 d時(shí)pH上升，在第10天時(shí)pH達(dá)到6.05，變化趨勢(shì)與冷藏牛肉一致，但變化較為平緩，原因是低溫抑制有害微生物及病原菌的生命活動(dòng)且在冰溫條件下牛肉細(xì)胞穩(wěn)定性高，理化性質(zhì)改變速度較慢，所以不易腐敗變質(zhì)。

圖3 不同儲(chǔ)藏溫度下牛肉pH的變化Fig.3 Changes of beef pH at different storage temperatures

2.3 儲(chǔ)藏期間牛肉損失率的變化

儲(chǔ)藏期間牛肉損失率的變化如圖4所示。在儲(chǔ)藏4 d時(shí)，冷藏條件下的牛肉比冰溫條件下的牛肉儲(chǔ)藏?fù)p失高1.4倍。在第10天時(shí)冰溫組、冷藏組的儲(chǔ)藏?fù)p失率分別為3.14%和4.31%。可能是由于冷藏組牛肉相較于冰溫組，微生物生命活動(dòng)相對(duì)旺盛，蛋白質(zhì)變性速度加快，使牛肉細(xì)胞系水力降低，進(jìn)而導(dǎo)致水分含量降低，而冰溫組能很好地抑制微生物活動(dòng)，從而降低了儲(chǔ)藏?fù)p失率。牛肉中的水主要包含自由水、結(jié)合水和不易流動(dòng)水，自由水最易損失，而儲(chǔ)藏牛肉與新鮮牛肉相比損失的可能是自由水，且細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如氨基酸、核苷酸等風(fēng)味成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)隨著水分流失[18]。

圖4 不同儲(chǔ)藏溫度下牛肉儲(chǔ)藏?fù)p失率的變化Fig.4 Changes of beef storage loss rates under different storage temperatures

2.4 儲(chǔ)藏期間牛肉中水分的存在狀態(tài)及遷移規(guī)律

牛肉在不同儲(chǔ)藏溫度下水分分布的情況見圖5和圖6，一共出現(xiàn)4個(gè)波峰，第1個(gè)波峰出現(xiàn)在0.1～1 ms之間為強(qiáng)結(jié)合水（T2b），第2個(gè)波峰出現(xiàn)在1.0～5.0 ms之間為弱結(jié)合水（T21），結(jié)合水與牛肉緊密相連，以致儲(chǔ)藏期間變化趨勢(shì)不顯著。第3個(gè)波峰在24～76 ms之間為不易流動(dòng)水（T22），且第3個(gè)波峰面積占總體達(dá)到85%以上。第4個(gè)波峰在150～230之間為自由水（T23）。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)波峰發(fā)生變化，說(shuō)明不同狀態(tài)水分發(fā)生了遷移或轉(zhuǎn)變，由于T22減小，說(shuō)明不易流動(dòng)水逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?/p>

圖5 冰溫條件下牛肉水分分布圖Fig.5 Water distributions of beef in ice temperature

圖6 冷藏條件下牛肉水分分布圖Fig.6 Water distributions of beef in cold storage

牛肉在不同儲(chǔ)藏溫度下橫向弛豫時(shí)間T2峰面積比的變化如表1所示。兩種儲(chǔ)藏溫度下T22、T2b和T21弛豫時(shí)間的峰面積均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，T23弛豫時(shí)間的峰面積呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，即牛肉中不易流動(dòng)水及結(jié)合水含量降低，自由水含量增加。由此可知，在儲(chǔ)藏期間牛肉內(nèi)3種狀態(tài)水分發(fā)生轉(zhuǎn)移，一部分不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤Ｓ蓤D5～6可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，-2℃條件下的牛肉T22、T23峰面積變化小于4℃條件，表明牛肉在冰溫條件下有著較高的持水性[19]，間接表示冰溫條件的保鮮效果優(yōu)于冷藏。

表1 不同儲(chǔ)藏溫度下牛肉橫向弛豫時(shí)間T2峰面積比的變化Table 1 Changes in T2 transverse relaxation times of beef under different storage temperatures

2.5 相關(guān)性分析

表2為通過Pearson法得出的牛肉在冰溫儲(chǔ)藏過程中水分遷移與蛋白質(zhì)氧化之間的相關(guān)性。在-2℃條件下，T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；T23與羰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表3為通過Pearson法得出的牛肉在冷藏過程中水分遷移與蛋白質(zhì)氧化之間的相關(guān)性。4℃條件下，T2b與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T21與羰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），T22與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T23與羰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表2 牛肉冰溫儲(chǔ)藏期間水分遷移與蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between beef water migrations and protein indices during ice temperature storage

表3 牛肉冷藏期間水分遷移與蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between beef water migrations and protein indices during cold storage

新鮮牛肉的含水量為70%～75%，在儲(chǔ)藏期間最易流失的部分為自由水。80%的自由水存在于肌原纖維和肌絲間，由肌纖維給予肌肉持水性。由于氧化后的肌原纖維橫向緊縮，導(dǎo)致肌細(xì)胞徑向減小且胞間距增加，從而使肌肉內(nèi)水分?jǐn)U散到肌纖維的空隙中，由于空隙中水分與肌肉的結(jié)合力不強(qiáng)，易被排除導(dǎo)致水分流失[20]。通過相關(guān)性分析得知，蛋白質(zhì)氧化與橫向弛豫時(shí)間T2呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，可以通過低場(chǎng)核磁共振弛豫時(shí)間T2表征蛋白質(zhì)的變化，且兩種儲(chǔ)藏溫度下T22與羰基的相關(guān)性最佳，與巰基也表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，因此用來(lái)表征蛋白質(zhì)氧化程度效果最好。

3 結(jié)論

（1）隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肉的pH、儲(chǔ)藏?fù)p失率以及羰基含量上升，而巰基含量下降，冷藏第10天時(shí)牛肉pH達(dá)到6.78，已腐敗變質(zhì)。

（2）根據(jù)橫向弛豫時(shí)間T2結(jié)果表明，結(jié)合水（T2b、T21）以及不易流動(dòng)水（T22）含量下降，自由水（T23）含量升高。通過相關(guān)性分析得出，冰溫條件下T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與巰基含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05）；T23與羰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。冷藏條件下T2b與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T21與羰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），T22與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T23與羰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

（3）牛肉蛋白質(zhì)氧化與水分遷移有良好的相關(guān)性，可以通過低場(chǎng)核磁共振弛豫時(shí)間T2表征蛋白質(zhì)的變化，且T22用來(lái)表征蛋白質(zhì)氧化程度效果最好。