廣西大宗特色水果果皮酵素的制備及其抗氧化作用研究

謝文佩，章 昱

（廣西中醫藥大學食品科學系，廣西 南寧 530222）

廣西是一個農業比重較大的省份，其獨特的資源優勢和氣候條件，十分適宜亞熱帶水果的生長。廣西水果產量位居全國第五，其中有不少地理標志保護產品，如永福羅漢果、容縣沙田柚、百色芒果等。但是這些水果不易貯存，除少部分用于直接銷售鮮食外，大部分用于加工，在加工的過程中產生了大量的加工副產物及廢棄物，比如菠蘿皮芯、芒果皮、柚子皮等，有研究表明果皮的抗氧化能力、VC含量及多酚含量相近或高于果肉[1-2]，其中還含有糖類和膳食纖維等，富含有益健康的營養成分[3]和較多的生理活性物質，能在發酵中提供碳源，抑制雜菌生長，有利于發酵[4-5]。這些副產物及廢棄物如若處理不當，不僅污染環境，同時浪費了大量的生物資源。

經發酵后的酵素液包含了植物原料和微生物原有的維生素及功能性化學物質，還有發酵生成的一些生理活性物質如次生代謝產物、抗氧化成分、醇類、酯類、酶類等[6]。目前，有關單種的果皮酵素或水果酵素研究較多[7-9]，但4種及以上的復合型酵素研究和報道不多。市面上的酵素大致分為果蔬類、糧谷類、中草藥類等[10]，發酵方式有自然發酵和經人工接種酵母菌、乳酸菌等微生物進行發酵，菌種影響酵素的生理活性和安全性，縮短了發酵時間[11]，對產品的生產工藝和品質起到一定的作用[12]。Liao等[13]利用乳酸菌發酵芒果汁，提高了芒果汁的活性物質含量和抗氧化活性；Ghosh等[14]研究表明，乳酸菌產生的有機酸能夠使原料中活性物質溶出并呈游離態。廣西富產的芒果、柚子、菠蘿等水果香氣濃郁，芬芳怡人，結合廣西特色羅漢果作為天然甜味劑，其熱量低、風味佳、兼具多重功能特性，刺梨富含超氧化物歧化酶（SOD），營養豐富[15]，具有獨特的酸味，營養價值較高，添加糖及能參與調節生理功能機制的益生元低聚半乳糖[16]，有利于提高酵素的香氣和口感。

本研究結合本地區農業經濟特色，聯合廣西果蔬加工企業，高效綜合利用果蔬加工廢棄物，變廢為寶，通過校企聯合，使水果加工產物創造更高的經濟價值。探究水果酵素的制備，通過Box-Behnken響應面設計試驗進行工藝優化，并對其進行抗氧化能力的測定，以期為促進廣西大宗特色水果加工及副產物產業鏈發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

菠蘿、柚子、火龍果、芒果、羅漢果、刺梨、紅糖：均為市售；安琪酵母酸奶發酵劑8菌型：購于安琪酵母旗艦店；低聚半乳糖：量子高科（中國）生物股份有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、三羥甲基氨基甲烷（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；鹽酸（分析純）：廉江市愛廉化試劑有限公司；鄰苯三酚（分析純）：天津市博迪化工有限公司；2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH）（含10%～20%苯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；759s紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；TD-5臺式低速離心機：四川蜀科儀器有限公司；手持折射儀0～90%Brix（糖）：邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

原料預處理→稱重→加入羅漢果→打漿→煮沸→加入刺梨、紅糖、低聚半乳糖→裝壇→冷卻→接種→密封→發酵→離心、過濾→裝瓶→成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 原料預處理

挑選成熟、無腐爛蟲害的菠蘿、柚子、火龍果、芒果，清洗、瀝干后削皮，備用。

1.2.2.2 稱重、打漿

稱取菠蘿皮、柚子皮、火龍果皮、芒果皮各100 g，加入6 g羅漢果，加入其總質量2倍的水，放入破壁機打碎成漿。

1.2.2.3 煮沸

將打好的漿液煮沸至起泡，加入8 g刺梨、適量紅糖、2%低聚半乳糖（占漿液總質量百分比）。

1.2.2.4 接種、密封

將冷卻好的漿液于超凈臺接入菌種1 g，搖晃均勻，密封。

1.2.2.5 發酵

將發酵后的漿液放在恒溫培養箱恒溫發酵。

1.2.2.6 離心、過濾

將完成發酵的果皮酵素置于低速離心機中離心，轉速4 000 r/min，時間15 min后過濾取濾液。

1.2.3 果皮酵素單因素試驗設計

利用超氧化物歧化酶活性和感官評分這兩個指標，選擇發酵溫度、發酵時間和紅糖添加量這3個因素設計單因素試驗。

（1）發酵時間：在發酵溫度40℃，紅糖添加量10%條件下，分析發酵時間（5、10、15、20、25 d）對果皮酵素SOD活性及感官評分的影響。

（2）發酵溫度：在發酵時間10 d，紅糖添加量10%條件下，分析發酵溫度（36、38、40、42、44℃）對果皮酵素SOD活性及感官評分的影響。

（3）紅糖添加量：在發酵溫度40℃，發酵時間20 d條件下，分析紅糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%）對果皮酵素SOD活性及感官評分的影響。

1.2.4 果皮酵素發酵工藝優化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，結合SOD活性和感官評分分析，進行響應面試驗，因素水平如表1所示。

表1 果皮酵素發酵響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test of pericarp fermentation

1.2.5 測定項目與方法

1.2.5.1 感官評定

邀請10位食品專業同學作為評價員對產品進行感官評定，果皮酵素感官評分標準見表2。

表2 果皮酵素感官評分標準表Table 2 Sensory scoring criteria for pericarp enzymes

1.2.5.2 超氧化物歧化酶活性

參照GB/T 5009.171—2003[17]中的方法測定，其中在特定條件下，1 min內轉化1微摩爾底物，或者底物中1微摩爾有關基團所需的酶量，稱為一個國際單位（U）。

1.2.5.3 抗氧化活性

參照T/SHRH 006—2018《化妝品-自由基（DPPH）清除實驗方法》[18]中的方法測定。

1.2.6 數據處理

采用Origin 2018 64Bit軟件制表格及作圖，Design Expert V8.0.6軟件制圖分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間對果皮酵素品質的影響

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，果皮酵素的SOD活性及感官評分均先上升后下降，當發酵時間為15 d時，感官評分及SOD活性出現最大值，分別為91.3分、239 U/mL，酵素品質較好。發酵時間小于15 d時，SOD活性和感官評分偏低，主要是因為發酵時間過短導致菌種產酸量較低、風味物質不足；發酵時間大于15 d時，過度繁殖的微生物會消耗酵素里的營養物質，次級代謝產物增多，導致酵素口感由醇厚變得稀薄，偏酸，營養成分下降[19]。因此，發酵時間選取15 d為宜。

圖1 發酵時間對果皮酵素SOD活性及感官評分的影響Fig.1 Effects of fermentation time on SOD activities and sensory scores of pericarp enzymes

2.1.2 發酵溫度對果皮酵素品質的影響

由圖2可知，隨著發酵溫度的增加，果皮酵素的SOD活性呈先上升后平緩的趨勢，感官評分呈先上升后下降的趨勢。發酵溫度影響益生菌的生長進而影響發酵的速度和乳酸的積累[20]，當發酵溫度為40℃時，感官評分達到最大，果皮酵素口感順滑，風味較佳，SOD活性處于上升趨勢，達到較高值（165 U/mL）；當發酵溫度為42℃時，微生物對糖的利用降低，產酸變少，SOD活性達到最大值（180 U/mL），但感官評分降低，果香味較淡，局部帶有少許雜色，帶有苦味；繼續升高發酵溫度，發酵速度過快，加速了菌種老化[21]，活性物質無明顯變化或減少，產品口感較為粗糙，苦味較重；溫度降低影響益生菌的發酵速率，產活性物質少。綜合考慮，確定單因素最佳發酵溫度為40℃。

圖2 發酵溫度對果皮酵素SOD活性及感官評分的影響Fig.2 Effects of temperatures on SOD activities and sensory scores of pericarp enzymes

2.1.3 紅糖添加量對果皮酵素品質的影響

如圖3所示，當紅糖添加量由5%升至15%時，隨著碳源的增加，產品中的活性物質含量升高，果皮酵素口感得到提升；在紅糖添加量為20%時，SOD活性達到最高值（270 U/mL），感官評分較高，說明此糖度對發酵酵素較為適宜；當紅糖添加量高于20%時，對產品的口感有消極影響，同時糖添加量過多形成高滲狀態，菌體利用糖源轉化成乳酸的能力下降，活力和生長速率被抑制[22]。因此，選取紅糖添加量為20%時較為適宜。

圖3 紅糖添加量對果皮酵素SOD活性及感官評分的影響Fig.3 Effects of brown sugar additions on SOD activities and sensory scores of pericarp enzymes

2.2 響應面試驗分析

利用Design Expert 8.06響應面軟件的Box-Behnken試驗設計3因素3水平優化工藝參數，試驗設計與結果見表3。

SOD是產品功效的重要指標之一，為了更好更客觀地評價產品的品質，故選取SOD活性作為主要指標進行分析。應用Design-Expert V8.0.6軟件對表3的試驗數據進行回歸分析，得到果皮酵素SOD活性（Y1）的回歸方程為：

Y1=296.80+20.75A-9.25C+11.25AB-30.25AC-11.75BC-28.28A2-62.27B2-51.20C2

對SOD活性的二次回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表3 響應面設計及結果Table 3 Response surface design and results

表4 SOD活性回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model on SOD activities

由表4可見，回歸模型極顯著（P=0.008 1＜0.01），調整決定系數=0.777 7，回歸模型的決定系數R2=0.902 8，說明該模型能解釋90.28%的變差，且該回歸模型與試驗擬合較好，能真實地描述各因素與響應值之間的關系，從回歸方程系數顯著性檢驗可知，各影響因子對果皮酵素SOD活性影響程度由大到小依次為：A紅糖添加量＞C發酵溫度＞B發酵時間，二次項B2對果皮酵素SOD活性影響極顯著（P＜0.01），C2的影響顯著（P＜0.05），可對果皮酵素SOD活性進行預測和分析。

為進一步探討發酵時間、溫度、紅糖添加量兩兩的交互作用對果皮酵素SOD活性的影響，繪制響應面圖，如圖4、5、6所示。

圖4 紅糖添加量及發酵時間的交互作用對SOD活性的影響Fig.4 Interaction effects of brown sugar additions and fermentation time on SOD activities

圖5 紅糖添加量及發酵溫度的交互作用對SOD活性的影響Fig.5 Interaction effects of brown sugar additions and temperatures on SOD activities

圖6 發酵溫度及發酵時間的交互作用對SOD活性的影響Fig.6 Interaction effects of temperatures and fermentation time on SOD activities

由圖4～6可以看出，紅糖添加量和發酵溫度交互作用的響應曲面圖最陡，二者的相互影響作用最明顯。隨著紅糖添加量和發酵溫度的增大，SOD活性呈先增大后基本保持不變的趨勢，說明酵素中的SOD活性己趨于最大值。

經過響應面分析得出以SOD活性為考察指標的果皮酵素發酵最佳工藝為：發酵時間14.41 d，溫度39.61℃，紅糖添加量17.05%。考慮實際操作，各參數稍作調整為：發酵溫度40℃，紅糖添加量17%，發酵時間15 d，SOD預測值為301.791 U/mL。按此工藝進行平行試驗，測得果皮酵素的SOD活性為300 U/mL，感官評分為95分。實測結果和預測結果接近，表明模型擬合良好，參數準確可靠。

2.3 抗氧化活性分析

檢測最優工藝條件下制備果皮酵素的抗氧化活性，由表5可知，發酵后酵素液的SOD活性從247.5 U/mL提高到300 U/mL，高出了52.5 U/mL，表明通過發酵果皮酵素中的SOD活性明顯提高，與單一的菠蘿（6.39 U/mL）、芒果（11.56 U/mL）、火龍果（4.71 U/mL）、柚子（2.51 U/mL）酵素相比[23]，混合果皮酵素SOD活性明顯升高；取濃度100%果皮酵素，發酵后對DPPH自由基清除率從64.6%增加到75.3%，但均低于4 mg/mL VC的DPPH自由基清除率。

表5 發酵前后功能活性物質比較Table 5 Comparison of functional active substances before and after fermentation

3 結論

本研究結合廣西地區農業經濟特色，聯合廣西果蔬加工企業，通過對廣西大宗特色水果的果皮酵素的發酵工藝優化及其抗氧化活性研究，結果表明，果皮酵素最佳工藝為：發酵時間15 d，發酵溫度40℃，紅糖添加量17%。該工藝下發酵得到的酵素產品呈紅棕褐色，富有果香味，口感細膩，SOD活性為300 U/mL，對DPPH自由基的清除率達75.3%。