地塞米松對急性淋巴細胞白血病患兒睡眠-覺醒節(jié)律及炎性細胞因子水平的影響

石桂鸞，徐曉燕

（沭陽銘和醫(yī)院兒科，江蘇 宿遷 223600）

小兒急性淋巴細胞白血病（Acute lymphoblastic leukemi）是一種由未分化的骨髓/淋巴樣造血干細胞發(fā)生異常克隆性增殖所導致的惡性疾病。有報道稱，急性淋巴細胞白血病患兒占急性白血病患兒總數的80%以上。3 ～7 歲的兒童是急性淋巴細胞白血病的高發(fā)群體。皮質類固醇激素是臨床上治療小兒急性淋巴細胞白血病的常用藥。Margolin 等[1]研究指出，在使用皮質類固醇激素對急性白血病患兒進行治療期間，盡管會根據其病情對皮質類固醇激素的用量和治療周期進行了調整，但此類藥物引起的不良反應仍不容忽視。皮質類固醇激素易導致的不良反應有疲勞、易怒、情緒低落、精神紊亂等[2-4]。地塞米松是臨床上常用的皮質類固醇激素之一。在北美，地塞米松已被臨床上廣泛應用于小兒急性白血病的治療中[1]。睡眠-覺醒節(jié)律是指夜間入睡、白天醒來這一人體生物節(jié)律。有研究指出，癌癥患者出現睡眠-覺醒節(jié)律紊亂主要與其存在癌因性疲乏有關。關于地塞米松對急性淋巴細胞白血病患兒睡眠-覺醒節(jié)律及炎性細胞因子水平的影響，臨床上的相關研究較少。本文主要是探討用地塞米松對急性淋巴細胞白血病患兒進行治療對其睡眠-覺醒節(jié)律及炎性細胞因子水平的影響。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選擇2015 年1 月至2020 年1 月期間我院收治的23 例急性淋巴細胞白血病患兒作為研究對象。其納入標準是：病情符合急性淋巴細胞白血病的診斷標準且初次得到確診；病歷資料完整；其家長簽署了自愿參與本研究的《知情同意書》。其排除標準是：由其他惡性腫瘤誘發(fā)的急性淋巴細胞白血病；合并有其他嚴重的器質性疾病；因病情復發(fā)入院。在這23 例患兒中，有男13 例，女10 例；其年齡為2 ～9 歲，平均年齡為5.5 歲。本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 根據美國兒童腫瘤協(xié)作組（Children’s oncology group，COG）推薦的“CCLG-2010”化療方案對這23 例患兒進行治療[5]。“CCLG-2010”化療方案包括：對患兒進行誘導化療所用的藥物為長春新堿（VCR）、柔紅霉素（DNR）和左旋門冬酰胺（L-Asp）。對患兒進行早期強化化療所用的藥物為環(huán)磷酰胺（CTX）、阿糖胞苷（Ara-C）和6- 巰基嘌呤（6-MP）。對病情危險程度為低危和中危的患兒進行鞏固化療所用的藥物為大劑量甲氨蝶呤（HDMTX）和6-巰基嘌呤（6-MP）。對病情危險程度為高危的患兒進行鞏固化療所用的藥物為甲氨蝶呤和（或）環(huán)磷酰胺-阿糖胞苷和（或）長春新堿-地塞米松（MTX/CA/VD）+6-MP。每30 d 為1 個化療周期。在1 個化療周期的第1 天至第5 天，讓患兒口服6 mg/m2的地塞米松，每天分2 次服用。

1.2.2 睡眠監(jiān)測方法 在1 個化療周期內，采用小米手環(huán)3（購自中國小米公司）對本研究中的23 例患兒進行睡眠監(jiān)測（在監(jiān)測前讓其佩戴手環(huán)1 周使其適應），主要監(jiān)測其夜間睡眠時間、白天睡眠（小睡）時間、清醒時間及睡眠中發(fā)生喚醒事件的情況。夜間睡眠時間定義為夜間睡眠開始的時間減去喚醒的時間。睡眠中的喚醒事件定義為在連續(xù)監(jiān)測過程中連續(xù)喚醒的次數。白天睡眠（小睡）時間定義為從早上醒來到當天晚上入睡之間的睡眠時間。

1.2.3 炎性細胞因子的檢測方法 在用地塞米松對患兒進行治療前及治療的第5 天，分別抽取其適量的靜脈血，對血液標本進行離心處理，分離出血漿，采用酶聯免疫吸附（Elisa）法檢測血漿中TNF-α、IL-1α 及IL-6 的水平。取小兒的急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1，用2μm 的地塞米松進行處理，在處理后的3 h 及后6 h 分別收集細胞的上清液，提取RNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的mRNA 水平。之后采用Elisa 法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的蛋白水平，采用蛋白質免疫印跡法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1α 及IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平。檢測時所用的人源性TNFα、IL-1α 和IL-6Elisa 試劑盒均購自上海萊茲生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒的說明書進行檢測。在檢測小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的mRNA 水平時，為了量化相對基因表達，將甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參。在進行qPCR 檢測時所用的引物如表1 所示。

表1 進行qPCR 檢測時所用的引物

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0.2（263）統(tǒng)計學軟件處理本研究中的數據，符合正態(tài)分布的計量數據采用均數± 標準差（±s）表示，用方差檢驗，兩組之間的差異采用t檢驗或雙因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量數據采用中位數（四分位數間距）表示，用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 地塞米松對患兒睡眠活動的影響

在1 個化療周期內對這23 例患兒進行睡眠監(jiān)測的結果顯示，在使用地塞米松的1 ～5 d 內，其夜間睡眠時間和白天睡眠（小睡）時間均明顯增加；在停用地塞米松后，其夜間睡眠時間和白天睡眠（小睡）時間均顯著下降。詳見圖1。

圖1 使用地塞米松后在1 個化療周期內患兒夜間睡眠時間及白天睡眠（小睡）時間的統(tǒng)計圖Figure 1 Statistics of nighttime sleep and daytime sleep (napping)within 30 days of dexamethasone (6 mg/m2/day) chemotherapy cycle

2.2 地塞米松對患兒血漿炎性細胞因子水平的影響

隨機在這23 例患兒中選取3 例患兒，在使用地塞米松進行治療的第5 天抽取其適量靜脈血，分離出血漿，采用Elisa 法檢測其血漿中TNF-α、IL-6 和IL-1α 的水平（記為Dexamethasone 組），并與這些患兒未使用地塞米松進行治療前其血漿TNF-α、IL-6 和IL-1α 的水平（記為Non組）進行比較，結果顯示，與治療前相比，治療后其血漿TNF-α、IL-6 和IL-1α 的水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 經地塞米松處理的小兒急性淋巴細胞中炎性細胞因子的mRNA 水平及蛋白水平

用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后3 h 及6 h，收集細胞的上清液，提取RNA，采用qPCR 法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α的mRNA 水平，結果顯示，用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后，細胞上清液中TNF-α、IL-6 和IL-1α 的mRNA 水平均顯著降低（詳見圖3）。用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后3 h 及6 h，收集細胞的上清液，采用Elisa 法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的蛋白水平，結果顯示，用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后，細胞上清液中TNF-α、IL-6 和IL-1α 的蛋白水平均顯著降低（詳見圖4）。用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后3 h 及6 h，收集細胞的上清液，采用蛋白質免疫印跡法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1α及IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平，結果顯示，用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后，細胞上清液中TNF-α、IL-1α 和IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平均顯著降低（詳見圖5）。由以上結果可知，用地塞米松對小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 進行處理后，細胞上清液中TNF-α、IL-1α 和IL-6 的蛋白水平和mRNA 水平均顯著降低，且IL-6 受體IL-6R 的表達受到顯著抑制。

圖2 應用地塞米松前后患兒血漿TNF-α、IL-6 及IL-1α 水平的變化Figure 2 The patient took venous blood 5 days after dexamethasone treatment and before treatment to separate the plasma. Elisa detected the protein levels of TNF-α, IL-6 and IL-1α in the child’s plasma.

圖3 經地塞米松處理的小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的mRNA 水平Figure 3 Pediatric acute lymphocytes RS4: 11,TOM-1 were treated with dexamethasone for 3 h and 6 h,cells were collected,RNA was extracted,and mRNA levels of TNF-α,IL-6 and IL-1α were detected

圖4 經地塞米松處理的小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的蛋白水平Figure 4 Pediatric acute lymphocytes RS4: 11,TOM-1 were treated with dexamethasone for 3 h and 6 h,and the cell supernatants were collected.Elisa detected the protein levels of TNF-α,IL-6 and IL-1α

圖5 經地塞米松處理的小兒急性淋巴細胞RS4:11 和TOM-1 中TNF-α、IL-6 及IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平Figure 5 Pediatric acute lymphocytes RS4: 11,TOM-1 were treated with dexamethasone for 3 h and 6 h,cells were collected,total protein was extracted,and protein levels of TNF-α,IL-6 and IL-1α were detected

3 討論

睡眠是身體發(fā)育、晝夜節(jié)律、體內穩(wěn)態(tài)和其他綜合因素的平衡過程。在睡眠時間方面，同一年齡段的兒童存在很大的個體化差異。隨著年齡的增長，兒童的睡眠時間會出現相應的變化[6-9]。但通常情況下兒童對夜間睡眠的需求基本一致[10-12]。本研究的結果顯示，急性淋巴細胞白血病患兒在使用地塞米松進行治療后，其夜間睡眠的時間延長，喚醒頻率降低，且大部分患兒恢復了白天短暫睡眠的習慣。這一結果與Hind 等[13]的研究結果相似。患兒在應用地塞米松后盡管其白天可短暫睡眠，但不會對其夜間睡眠造成影響。有研究證實，急性淋巴細胞白血病患兒在應用大劑量的地塞米松后，可能對其下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）和（或）體內的多種細胞因子產生影響，進而可對其睡眠造成影響[14-17]。有研究指出，皮質類固醇激素可通過對神經系統(tǒng)進行多層次的影響〔如提高警覺性或間接地通過反饋機制抑制促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）的釋放〕而影響睡眠[18-22]。CRH 可激活藍斑-去甲腎上腺素系統(tǒng)，從而可降低清醒度并增加慢波睡眠。地塞米松已被證實可增加慢波睡眠及促進白天嗜睡[23-24]。地塞米松對睡眠的影響可能涉及到炎性細胞因子。Zupanec 等[25]研究指出，TNF-α、IL-1α 和IL-6 在睡眠調節(jié)中起著重要作用。Sadeh 等[26]研究發(fā)現，TNF-α 與IL-6 單核苷酸的多態(tài)性與急性淋巴細胞白血病患兒出現睡眠紊亂有關。TNF-α、IL-1α 和IL-6 被認為是研究人類和動物“疾病綜合征”的媒介，這三種炎性細胞因子被認為是介導疲勞的重要因子[27-33]。

綜上所述，用地塞米松對急性淋巴細胞白血病患兒進行治療能增加其夜間睡眠時間和白天睡眠（小睡）時間，抑制其體內TNF-α、IL-1α 和IL-6 的表達。地塞米松影響急性淋巴細胞白血病患兒睡眠的機制可能與此藥能夠抑制患兒體內TNF-α、IL-1α 和IL-6 的表達有關。