食源性致病菌快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

姚幫本，閆 超，姚 麗，陳趙然*，陳 偉*

(1.安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 安徽 合肥 230051；2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院 安徽 合肥 230009)

“民以食為天，食以安為先”，食品安全關(guān)乎著人們“舌尖上的安全”，直接影響人民群眾的身體健康和生命安全。食品安全問(wèn)題是指生物和化學(xué)性等因素從原材料到成品各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)食品所帶來(lái)的潛在影響和對(duì)人類(lèi)健康造成的危害。影響因素主要包括食源性致病微生物、農(nóng)獸藥濫用、重金屬、真菌毒素污染、非法添加、摻雜使假以及食品接觸材料中的危害成分遷移等。食源性致病菌污染是導(dǎo)致食源性疾病的主要原因，美國(guó)每年都有約4 800萬(wàn)例食源性疾病患者(相當(dāng)于六分之一的美國(guó)人)，約12.8萬(wàn)人住院和3 000人死亡[1]。目前常見(jiàn)的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌、致病性弧菌、彎曲桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和阪崎腸桿菌等[2]。常規(guī)的檢測(cè)方法主要有平板分離法、化學(xué)分析法和免疫分析法等。但這些方法都或多或少存在不足，如步驟繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高、對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)水平要求高。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、靈敏、快速和低成本的檢測(cè)復(fù)雜食品樣品中致病菌的方法成為迫切需求。

本文綜述了以免疫分析、分子生物學(xué)、生物傳感器、代謝學(xué)、核酸適配體為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)食源性致病菌的方法，闡述了各方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀等，并討論了現(xiàn)有快速檢測(cè)方法存在的問(wèn)題和未來(lái)的發(fā)展方向，以期為食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供參考，對(duì)各學(xué)科研究和食品安全監(jiān)管具有一定意義。

1 食源性致病菌快速檢測(cè)方法

1.1 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[2-3](Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)是將抗原與抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)結(jié)合到一起的測(cè)定技術(shù)，具有靈敏度高、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，所需儀器化程度低，樣本前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，特別適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。

Zhai等[4]采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備了7株阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體，用其中一株建立的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)106CFU/mL。Feng等[5]利用雙抗夾心ELISA法對(duì)大腸埃希氏菌O157∶H7進(jìn)行了檢測(cè)(示意圖見(jiàn)圖1)，結(jié)果表明，該方法在105～108CFU/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，靈敏度達(dá)1×104CFU/mL。此外，經(jīng)過(guò)8 h的增菌，該方法對(duì)人工污染的綠茶樣品中大腸埃希氏菌O157∶H7的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.4 CFU/g。

圖1 雙抗夾心ELISA法原理示意圖Fig.1 Sandwich ELISA principle diagram

1.1.2 免疫層析技術(shù)免疫層析(Immuno chromatography，IC)技術(shù)的檢測(cè)原理是將目標(biāo)物的特異性抗體固定在硝酸纖維素膜上，然后目標(biāo)物在毛細(xì)管層析的作用下從樣品區(qū)向硝酸纖維素膜遷移，在經(jīng)過(guò)固定有特異性抗體的區(qū)域時(shí)，抗原抗體發(fā)生特異性免疫識(shí)別反應(yīng)，使目標(biāo)物被固定在特定的區(qū)域，最后再通過(guò)肉眼、紫外或紅外光激發(fā)、酶促反應(yīng)顯色等方法判定檢測(cè)結(jié)果。該項(xiàng)技術(shù)操作方便，讀取結(jié)果的時(shí)間最短的只需3～5 min，最長(zhǎng)不超過(guò)30 min。高度特異的抗原抗體反應(yīng)可保證該檢測(cè)結(jié)果保持很高的特異性和靈敏度。一般只需不到100 μL樣本即可得到檢測(cè)結(jié)果。產(chǎn)品只需室溫保存，有效期長(zhǎng)，適用范圍廣，移植能力強(qiáng)，且非專(zhuān)業(yè)人員也可以操作。

Hassan等[6]首次使用單克隆抗體熒光橫向流動(dòng)免疫分析法檢測(cè)了牛肉中的大腸桿菌O157∶H7，這種新方法的靈敏度是傳統(tǒng)橫向流動(dòng)分析方法的數(shù)千倍，在牛肉中的檢出限為178 CFU/g。此外，該方法的檢測(cè)成本比傳統(tǒng)方法低60%，且結(jié)果可采用智能手機(jī)讀取。Liu等[7]建立了一種檢測(cè)水產(chǎn)品和腹瀉患者糞便中副溶血性弧菌的免疫層析方法，該方法對(duì)副溶血性弧菌有很高的特異性和敏感性，檢出限為1.2×103CFU/mL，對(duì)32株目標(biāo)菌、13個(gè)白蝦和146個(gè)腹瀉患者糞便樣本的敏感性和特異性檢測(cè)率均為100 %。Qi等[8]將免疫磁性納米顆粒與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速、高靈敏檢測(cè)大腸埃希氏菌O157∶H7的方法，靈敏度從105CFU/mL提高到103CFU/mL。吳穎等[9]開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙條方法，將一種金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的單克隆抗體連接膠體金，通過(guò)另一株SPA的單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，制備雙抗夾心法膠體金免疫層析試紙條，靈敏度達(dá)1×106CFU/mL。Chen等[10]使用末端功能化的引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，開(kāi)發(fā)了一種基于量子點(diǎn)的快速、高敏檢測(cè)金黃色葡萄球菌的免疫層析試紙條方法，在奶粉和肉類(lèi)樣本中的檢測(cè)限分別為3×100CFU/mL和3×101CFU/g。Noguera等[11]用碳納米粒子標(biāo)記中性抗生物素蛋白，利用雙修飾的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，建立了一種可以針對(duì)大腸桿菌不同基因的免疫層析試紙條檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)104～105CFU/mL。

1.1.3 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique，IFT)通過(guò)將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上，使之在與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，于熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應(yīng)。目前普遍使用的熒光色素是免疫熒光微球和量子點(diǎn)。使用熒光色素標(biāo)記的抗體作為特異性免疫熒光探針，通過(guò)與致病菌結(jié)合復(fù)合物的熒光強(qiáng)度變化可實(shí)現(xiàn)致病菌的定量檢測(cè)[12]。

免疫熒光技術(shù)具有發(fā)射波長(zhǎng)可控、光穩(wěn)定性好、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，還可與其他技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行食源性致病菌的檢測(cè)。Xue等[13]將免疫磁性納米粒子和免疫量子點(diǎn)相結(jié)合，對(duì)大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行定量檢測(cè)，2 h內(nèi)即能檢測(cè)到低至14 CFU/mL的大腸桿菌O157∶H7。Mitchell等[14]應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，檢測(cè)限為49×10-15mol/L。Hu等[15]采用量子點(diǎn)進(jìn)行熒光標(biāo)記檢測(cè)金黃色葡萄球菌，檢出限為103CFU/mL，該方法的樣品不需進(jìn)行預(yù)處理與增菌，可直接進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間約為3 h。此外，法國(guó)梅里埃公司的全自動(dòng)免疫分析儀(VIDAS)的原理即是基于酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)：包被了固相抗體的固相吸附器捕獲樣品中目標(biāo)菌的特異性抗原，隨后堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗再與目標(biāo)菌的特異性抗原結(jié)合，二抗連續(xù)的堿性磷酸酶將底物水解，產(chǎn)生的磷酸-4-甲基傘形酮在370 nm下能夠產(chǎn)生熒光，將測(cè)定的熒光強(qiáng)度與設(shè)定閾值的大小進(jìn)行比較，若高于閾值則判斷結(jié)果為陽(yáng)性，低于閾值則判斷為陰性。王似錦等[16]采用全自動(dòng)免疫分析儀對(duì)保健食品中沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)時(shí)間可以縮短至48 h。

1.1.4 免疫磁分離技術(shù)免疫磁分離技術(shù)(Immunomagnetic beads separation techniques，IMBS)作為食品樣品有效的預(yù)濃縮技術(shù)，能夠快速地從復(fù)雜食品基質(zhì)中選擇性分離和濃縮靶細(xì)菌。其主要原理是超順磁性顆粒表面經(jīng)化學(xué)修飾后，與靶細(xì)菌特異性的活性蛋白質(zhì)結(jié)合制成免疫磁珠(Immunomagnetic beads，IMBs)，然后IMBs上的抗體將會(huì)特異性識(shí)別與捕獲待檢樣品中的目標(biāo)菌,形成IMBs-目標(biāo)菌復(fù)合物。最后依靠磁場(chǎng)的作用力快速地使復(fù)合物與樣品中其他雜質(zhì)分離，從而達(dá)到高效、精準(zhǔn)濃縮目標(biāo)微生物的目的。

免疫磁分離技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、分離速度快的特點(diǎn)[17-18]，可與多種其他技術(shù)相結(jié)合達(dá)到快速檢測(cè)食源性致病菌的效果。Chen等[19]采用免疫磁分離技術(shù)和PCR相結(jié)合的方法檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌，檢出限達(dá)52 CFU/mL，檢測(cè)方法靈敏、快速。Zeng等[20]建立了一種免疫磁分離-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(IMS-LAMP)技術(shù)檢測(cè)牡蠣中副溶血性弧菌的快速方法，該方法特異性良好，經(jīng)8 h前增菌后，最低檢測(cè)限達(dá)到0.19 CFU/g，檢測(cè)時(shí)間縮至24 h?？軙跃У萚21]將免疫磁分離技術(shù)和ATP發(fā)光技術(shù)聯(lián)合用于沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法有良好的線(xiàn)性相關(guān)性，檢測(cè)限低至102CFU/mL。Huang等[22]將免疫磁分離技術(shù)與熒光納米針橫向流動(dòng)相結(jié)合檢測(cè)生乳中的大腸桿菌O157∶H7。使用免疫磁分離技術(shù)后，熒光納米針橫向流動(dòng)試紙條的熒光信號(hào)值增強(qiáng)，說(shuō)明免疫磁分離技術(shù)可富集大腸桿菌O157∶H7并減少食品基質(zhì)的干擾。

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體(或抗原)為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專(zhuān)一性相結(jié)合的一種免疫方法，對(duì)標(biāo)記用酶具有特定要求，如活性高、純度高等;對(duì)相應(yīng)的標(biāo)記物也有特定要求，如熒光標(biāo)記物需熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定，易于保存等。免疫技術(shù)受靈敏度和精確度的限制，一般用來(lái)對(duì)大量樣本進(jìn)行初篩，最終精準(zhǔn)定量需要借助儀器確認(rèn)。

1.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子生物學(xué)是從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)，其發(fā)展始于Crick和Watson[23]在1953年提出的雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著現(xiàn)代分子生物學(xué)的興起。分子生物學(xué)技術(shù)具有高靈敏度和特異性，被廣泛用于食源性致病菌的檢測(cè)。常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)、多重PCR(mPCR)、實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qPCR)、數(shù)字PCR和基因芯片等。

1.2.1 PCR技術(shù)PCR技術(shù)是最早發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是以變性、退火、延伸為周期循環(huán)進(jìn)行的體外DNA擴(kuò)增的過(guò)程，可在短時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)基因成倍增加，擴(kuò)大檢測(cè)對(duì)象的數(shù)量，從而提高檢測(cè)靈敏度。

Rahn 等[24]在1992年第一次設(shè)計(jì)了一對(duì)沙門(mén)氏菌invA基因的引物來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌，采用此方法檢測(cè)了100多個(gè)血清型的630株沙門(mén)氏菌，對(duì)照組由21屬細(xì)菌的142個(gè)非沙門(mén)氏菌菌株組成。結(jié)果僅有4株未檢出，檢出率為99.4 %。Pinto等[25]將PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)相結(jié)合，對(duì)貝類(lèi)中副溶血性弧菌的一個(gè)特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針捕獲地高辛(DIG)標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度較普通PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳提高了100倍。PCR技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，但易受污染，且無(wú)法對(duì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的死亡菌株進(jìn)行識(shí)別，因而可能出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶。

PCR技術(shù)也是食源性致病菌快速檢測(cè)的常用方法。但該方法的擴(kuò)增結(jié)果不能肉眼直接識(shí)別，需要借助凝膠電泳等方法進(jìn)行表征，在定量豐度低的不可培養(yǎng)微生物時(shí)的準(zhǔn)確性不強(qiáng)。

1.2.2 多重PCR技術(shù)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Multiplex polymerase chain reaction，mPCR)，是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上，在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物和模板(引物與相對(duì)應(yīng)的模板特異性結(jié)合)同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)不同序列的DNA片段。在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，可同時(shí)檢測(cè)多種食源性致病菌，減少實(shí)驗(yàn)操作次數(shù)、縮短檢測(cè)時(shí)間、節(jié)省試劑。

楊國(guó)興等[26]選取金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門(mén)氏菌SipB基因、志賀氏菌ipaH基因和單增李斯特菌inlA基因作為目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)了4對(duì)PCR引物，建立并優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)體系，評(píng)價(jià)了該體系的特異性和靈敏度，并對(duì)人工污染的熟肉樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示構(gòu)建的多重PCR方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，人工污染熟肉勻漿中4種致病菌的檢出限為103CFU/mL。熊蘇玥等[27]選取金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門(mén)氏菌的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白基因(hilA)、大腸桿菌O157∶H7鞭毛基因(flic)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力調(diào)控蛋白基因(prfA)及霉菌18S rRNA基因V5區(qū)，分別設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物，并對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，確定獲得特異性良好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。隨后在37 ℃下對(duì)人工污染致病菌的香腸、面包和豆腐進(jìn)行增菌培養(yǎng)，5種致病微生物在20 h內(nèi)的檢出限均可達(dá)到10 CFU/25 g。Yang等[28]將多重PCR與膜芯片技術(shù)聯(lián)用，可同時(shí)檢測(cè)非預(yù)包裝即食食品中9種食源性致病菌，綜合檢出限達(dá)0.01 ng核酸樣本。

多重PCR技術(shù)適合檢測(cè)癥狀相同或易污染相同食品的多種食源性致病菌，可使食品中微生物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。由于多對(duì)引物在同一體系中進(jìn)行擴(kuò)增，各對(duì)引物之間相互影響，因此多重PCR實(shí)際操作過(guò)程中的擴(kuò)增效果和實(shí)際擴(kuò)增的片段數(shù)目往往不盡如人意。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)是在PCR體系中加入熒光標(biāo)記的探針或熒光物質(zhì)，并通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的積累，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知濃度的樣品進(jìn)行定量分析的方法。

Nadin-Davis等[29]采用qPCR方法，以6個(gè)靶基因快速檢測(cè)腸道沙門(mén)氏菌，對(duì)239個(gè)家禽設(shè)施中的樣本進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明qPCR和普通培養(yǎng)方法在結(jié)果上呈現(xiàn)出良好的一致性，且qPCR方法比普通培養(yǎng)方法更省時(shí)。目前市面上有一種新型干燥型熒光PCR檢測(cè)試劑盒[30]，可對(duì)副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7和單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒干燥后不影響酶的活性，可常溫運(yùn)輸保存、運(yùn)輸，對(duì)上述3種食源性致病菌的檢測(cè)靈敏度分別為140、380、7 900 CFU/mL，與常見(jiàn)品牌試劑盒效果相當(dāng)。此外，Alia等[31]開(kāi)發(fā)了一種獨(dú)特的四重實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，該方法能夠區(qū)分加工肉制品和即食肉制品中4種血清型的單核細(xì)胞增生李斯特菌，具有高靈敏度、高特異性和快速的特點(diǎn)，對(duì)于識(shí)別肉制品加工過(guò)程中單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染來(lái)源和即食肉制品中持久性菌株的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)很有意義。張焱鑫等[32]用實(shí)時(shí)熒光PCR法和國(guó)標(biāo)法對(duì)采集的60件畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品和乳及乳制品中的沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果表明，除金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性外，其他3種致病菌2種方法均有檢出，但實(shí)時(shí)熒光PCR法的陽(yáng)性率均高于國(guó)標(biāo)法。

qPCR是一項(xiàng)融合了多種技術(shù)的檢測(cè)手段，與普通PCR相比,qPCR技術(shù)的核酸擴(kuò)增在封閉系統(tǒng)中完成，擴(kuò)增完成后不需進(jìn)行電泳分析，不僅減少了樣品的污染機(jī)會(huì)，也避免了污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果，縮短了檢測(cè)時(shí)間。具備重復(fù)性好、快速、實(shí)時(shí)性強(qiáng)、靈敏度高、可定量檢測(cè)的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為食源性致病菌檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)成本較高，所需儀器昂貴，需要操作人員具有較高的專(zhuān)業(yè)技術(shù)水平。

1.2.4 數(shù)字PCR技術(shù)數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)技術(shù)是將qPCR體系等量均分到相互隔離的大數(shù)量(多數(shù)大于10 000個(gè))微小的反應(yīng)單元(芯片微孔或微滴液珠)中，且理想狀態(tài)下一個(gè)反應(yīng)體系中至多包含一個(gè)待測(cè)核酸分子。dPCR的反應(yīng)過(guò)程與qPCR相似，擴(kuò)增后的核酸分子在熒光下顯示熒光信號(hào)(表示為“1”)，或沒(méi)有熒光信號(hào)(表示為“0”)，通過(guò)泊松分布對(duì)熒光信號(hào)“0”和“1”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸含量的測(cè)定。dPCR不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，無(wú)需通過(guò)Ct值(PCR熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))進(jìn)行濃度比較，被認(rèn)為是一種絕對(duì)定量的方法[33-35]。數(shù)字PCR原理示意圖見(jiàn)圖2。微滴式數(shù)字PCR((Droplet digital PCR，ddPCR)是一種將單個(gè)目標(biāo)DNA分子分散到多個(gè)分離的液滴中，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微液滴進(jìn)行檢測(cè)，精確定量DNA拷貝數(shù)的新方法。在ddPCR檢測(cè)中，目標(biāo)DNA分子的分布服從泊松統(tǒng)計(jì)，這意味著大多數(shù)反應(yīng)要么包含一個(gè)目標(biāo)，要么不包含目標(biāo)。理想情況下，ddPCR陽(yáng)性反應(yīng)的數(shù)量等于最初存在的模板DNA分子的數(shù)量[36]。

圖2 數(shù)字PCR原理示意圖Fig.2 Principle diagram of digital PCR

馬薇等[37]以大腸菌群的lacZ基因?yàn)榘谢?，建立了一種快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的ddPCR定量檢測(cè)方法，可檢出每μL單個(gè)拷貝數(shù)的大腸菌群lacZ基因組DNA。方佩佩等[38]用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)建立了副溶血性弧菌的快速定量檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該法檢測(cè)特異性好，副溶血性弧菌有效基因組DNA濃度范圍為2～19 440拷貝/20 μL，分析得菌懸液濃度為50～4.86×105CFU/mL，與3M測(cè)試片所得菌懸液濃度無(wú)顯著性差異；與熒光PCR相比，ddPCR可以進(jìn)行更低濃度檢測(cè)且能準(zhǔn)確定量。Li等[39]采用一種ddPCR方法對(duì)蘋(píng)果汁、牛奶和菠菜洗液中的大腸埃希氏菌O157∶H7和O104∶H4進(jìn)行定量檢測(cè)，在蘋(píng)果汁中的檢出限達(dá)2 CFU/mL。鄧雪蕾等[40]設(shè)計(jì)制作了一種基于聚二甲基硅氧烷-玻璃的多功能集成式ddPCR芯片，對(duì)副溶血性弧菌基因組DNA進(jìn)行絕對(duì)定量，定量的線(xiàn)性范圍跨越5個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)結(jié)果與理論參考濃度間具有良好的相關(guān)性。

數(shù)字PCR技術(shù)具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，已在稀有突變檢測(cè)和復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè)等方面得到廣泛的應(yīng)用。

1.2.5 基因芯片技術(shù)基因芯片(Gene chip，GC)是一種新型的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。GC通過(guò)采用原位合成或顯微點(diǎn)樣技術(shù)將大量DNA探針有規(guī)律地固化于玻璃芯片或硅芯片載體上，然后與待測(cè)標(biāo)記樣品按堿基配對(duì)原理雜交，經(jīng)放射自顯影、激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等掃描芯片，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，獲得樣品的基因序列、基因表達(dá)等遺傳信息[41-42]。

近年來(lái)，采用基因芯片技術(shù)對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)的研究逐漸增多，Suo等[43]利用基因芯片與多重PCR相結(jié)合的技術(shù)檢測(cè)了大腸桿菌O157∶H7、沙門(mén)氏菌的3個(gè)種、空腸彎桿菌以及單核細(xì)胞增生李斯特菌。Day等[44]利用懸浮芯片系統(tǒng)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，使用磁性微球-抗體偶聯(lián)物對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌上存在的特異性膜蛋白進(jìn)行識(shí)別，可在24 h內(nèi)識(shí)別哈密瓜和包裝沙拉中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，最低檢出限達(dá)到100CFU/g?；蛐酒夹g(shù)的自動(dòng)化程度高，可一次分析大量樣品，數(shù)據(jù)客觀可靠。但成本昂貴、檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差，分析泛圍較狹窄。

1.2.6 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物,并利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(65 ℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具有高特異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)。

LAMP技術(shù)是Notomi等[45]于2000年開(kāi)發(fā)的一種靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短的核酸擴(kuò)增方法。近年來(lái)越來(lái)越多被應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)。關(guān)玉婷等[46]根據(jù)沙門(mén)氏菌特異性靶基因腸毒素stn基因設(shè)計(jì)了4條LAMP引物，建立的LAMP方法僅需30 min即可得到準(zhǔn)確結(jié)果，可視化LAMP方法對(duì)3株沙門(mén)氏菌和8株非沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出良好的檢測(cè)特異性。杜琳等[47]針對(duì)金黃色葡萄球菌的TRAP基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了金黃色葡萄球菌的LAMP測(cè)定方法，與生鮮乳中常見(jiàn)的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、無(wú)乳鏈球菌、糞腸球菌無(wú)交叉反應(yīng)，靈敏度為10 CFU/mL。Babu等[48]采用LAMP技術(shù)對(duì)致病性彎曲桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)，樣本包括純培養(yǎng)物和陽(yáng)性污染的即食食品，最低檢出限達(dá)6 CFU每反應(yīng)。Garrido-Maestu等[49-50]建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)不同類(lèi)型食物中單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法，檢出限可低于10 CFU/25 g。Xu等[51]針對(duì)不同乳制品中的常見(jiàn)食源性致病菌，基于LAMP建立了便捷、快速、高效的檢測(cè)方法，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程可在30 min內(nèi)完成，最低檢出限可到1拷貝。

LAMP是一種實(shí)用價(jià)值及檢測(cè)效率很高的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),同時(shí)也存在著明顯的缺點(diǎn)：如加入環(huán)引物后，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；雖然可借助各種方式減少假陽(yáng)性發(fā)生的頻率，但依舊無(wú)法避免其對(duì)引物設(shè)計(jì)要求高、難度大的缺陷；LAMP不適用于擴(kuò)增較長(zhǎng)片段，因?yàn)槠洚a(chǎn)物不均勻，擴(kuò)增產(chǎn)物組成復(fù)雜，多種長(zhǎng)度片段共存的產(chǎn)物起不到再次驗(yàn)證擴(kuò)增特異性的作用，且在反應(yīng)體系中容易被污染[52]。

1.3 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器(Biosensor)是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并可將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器，是以固定化的生物敏感材料作識(shí)別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))，由適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體等)及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。根據(jù)工作原理不同，生物傳感器可以分為：光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、酶生物傳感器、物理生物傳感器、機(jī)械生物傳感器等。生物傳感器檢測(cè)技術(shù)由于高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，被廣泛用于食源性致病菌的檢測(cè)。下面主要介紹使用較多的光學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器。

1.3.1 光學(xué)生物傳感器光學(xué)生物傳感器(Optical biosensors)檢測(cè)技術(shù)憑借檢測(cè)快速和靈敏度高的特性被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)。光學(xué)傳感器可通過(guò)折射率的原位檢測(cè)或通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞附著在傳感器表面受體上的厚度來(lái)區(qū)分食品中的微生物。光學(xué)傳感器還包括一種可生物降解的聚合物，由微生物在天然產(chǎn)物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶組成。目前主要的光學(xué)傳感技術(shù)有比色、熒光、化學(xué)發(fā)光和表面等離子共振等。

Shang等[53]開(kāi)發(fā)了一種基于化學(xué)發(fā)光的光學(xué)生物傳感器檢測(cè)食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，在優(yōu)化條件下，對(duì)牛奶中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)時(shí)間僅為40 min，最低檢測(cè)濃度達(dá)到1.1 logCFU/mL。Kim等[54]發(fā)明了一種可視化的比色生物傳感器來(lái)檢測(cè)嬰幼兒乳粉中的阪崎腸桿菌，在最優(yōu)條件下，30 min內(nèi)能直觀檢測(cè)到的最低濃度為7.1×103CFU/mL。Mudgal等[55]用BaTiO3-石墨烯-親和層表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)檢測(cè)假單胞菌，檢測(cè)時(shí)間為25 min，檢出限為7.09 logCFU/mL。

1.3.2 電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)生物傳感器(Electrochemical biosensor)通常將抗體、酶、適體、多肽等生物敏感物質(zhì)或細(xì)胞器、細(xì)胞、組織等生物組分作為識(shí)別元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件。將生物識(shí)別元件通過(guò)生物固定化技術(shù)固定在電極上后，生物分子間特異性識(shí)別產(chǎn)生的各種物理、化學(xué)等信號(hào)將由電極轉(zhuǎn)換成電阻、電位、電流或電容等物理量形式并作為特征檢測(cè)信號(hào)輸出，從而實(shí)現(xiàn)被測(cè)物的檢測(cè)[56]。根據(jù)固定在電極表面的生物識(shí)別元件不同，電化學(xué)生物傳感器可分為電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?、電化學(xué)免疫傳感器、電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)適體傳感器、電化學(xué)多肽傳感器等[57]。

Saini等[58]利用特異性的NH2標(biāo)記探針建立了一種基于DNA的納米傳感器，用于檢測(cè)牛奶樣品中腸炎沙門(mén)氏菌的stn基因。采用循環(huán)伏安法(CV)和微分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行電化學(xué)表征，DPV檢測(cè)靈敏度為728.42 (μA/cm2)/ng，檢測(cè)下限為1.8 pg/6 μL (0.3 pg/mL)。Sobhan等[59]用多克隆抗體成功固定了一種單壁碳納米管生物傳感器，在泡菜中檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，最低檢出限達(dá)104CFU/mL。Silva等[60]開(kāi)發(fā)了一種在蘋(píng)果汁中檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌的方法，該方法使金納米粒子聚合物與包裹膜上的電位生物傳感器結(jié)合，最低檢出限達(dá)6 CFU/mL。Ge等[61]建立了一種簡(jiǎn)便的鼠傷寒沙門(mén)氏菌電化學(xué)檢測(cè)傳感器，靈敏度達(dá)16 CFU/mL，線(xiàn)性范圍為20～2×108CFU/mL，具有良好的信號(hào)放大性能，重復(fù)性好，基質(zhì)效應(yīng)低。

1.4 代謝學(xué)檢測(cè)技術(shù)

代謝學(xué)檢測(cè)技術(shù)是食源性致病菌檢測(cè)的一種常用技術(shù)手段。其原理是利用各種技術(shù)檢測(cè)不同致病菌在特定培養(yǎng)環(huán)境下產(chǎn)生的初級(jí)代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物的量和種類(lèi)的變化特征以對(duì)該致病菌進(jìn)行鑒定。按照檢測(cè)技術(shù)不同，分為電阻抗技術(shù)、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光技術(shù)、放射測(cè)量技術(shù)和微熱量計(jì)技術(shù)等。下面對(duì)使用較多的電阻抗技術(shù)和ATP生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行介紹。

1.4.1 電阻抗技術(shù)電阻抗技術(shù)依據(jù)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝活動(dòng)的不同，通過(guò)電阻抗技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)鑒定。Dong等[62]改進(jìn)了電阻抗檢測(cè)技術(shù)，使用金納米顆粒和聚胺多壁碳納米管-殼聚糖納米復(fù)合膜修飾玻碳電極(AuNPs/PAMAM-MWCNT-Chi/GCE)來(lái)檢測(cè)牛奶中的沙門(mén)氏菌，與僅用六氰化鐵氧化還原電極的阻抗檢測(cè)法相比，靈敏度提高至5.0×102CFU/mL。Tan等[63]在用聚二甲基硅氧烷(PDMS)阻抗免疫生物傳感器檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)，選取多孔氧化鋁膜固定抗體，檢測(cè)靈敏度為102CFU/mL。Dweik等[64]證實(shí)，采用阻抗免疫生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7時(shí)，其抗原抗體結(jié)合率與反應(yīng)時(shí)間之間不存在明顯的線(xiàn)性關(guān)系，反應(yīng)60 min后，抗原抗體結(jié)合率最高。Chowdhury等[65]使用阻抗免疫生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，選取聚苯胺(PANI)作為工作電極，檢測(cè)線(xiàn)性范圍為102～107CFU/mL。

1.4.2 ATP生物發(fā)光技術(shù)ATP生物發(fā)光技術(shù)利用活菌內(nèi)含有ATP，當(dāng)細(xì)菌死亡后其內(nèi)的ATP被細(xì)胞內(nèi)酶分解，應(yīng)用熒光素和熒光素酶可使之釋放能量并產(chǎn)生熒光，且熒光量與ATP濃度成正比的原理進(jìn)行檢測(cè)。因此，通過(guò)測(cè)定ATP濃度即可推算出活菌總數(shù)[66-67]。Chang等[68]在最佳的ATP再生條件下偶聯(lián)生物發(fā)光法，對(duì)ATP標(biāo)準(zhǔn)品、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的檢測(cè)限分別為10-17mol/mL、102CFU/mL和102CFU/mL。該方法無(wú)需對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)便、快捷且測(cè)定范圍廣，由于檢測(cè)的是食品中的活菌總數(shù)，更能準(zhǔn)確反映食品衛(wèi)生的真實(shí)情況。其不足之處在于：易受溫度、酸堿等因素影響，食品和ATP提取劑含有的某些離子會(huì)干擾測(cè)定；不能進(jìn)行細(xì)菌鑒定；靈敏度有待提高；僅適用于細(xì)菌含量高的物質(zhì)。該方法無(wú)特異性，但可通過(guò)用免疫磁分離技術(shù)(IMS)捕獲靶細(xì)菌再進(jìn)行熒光測(cè)定進(jìn)行克服[69]。

1.5 核酸適配體檢測(cè)技術(shù)

核酸適配體(Aptamer)是從包含隨機(jī)序列的巨大核酸分子庫(kù)中篩選出來(lái)的一種單鏈DNA或RNA配體，是一段能特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子的15～90個(gè)堿基寡核苷酸片段。這些特異性選擇的核酸序列可以結(jié)合廣泛的非核酸靶點(diǎn)，并且具有高親和力和高特異性。同時(shí)，所選已知序列的適配體可批量制備，易于官能團(tuán)修飾，與生物分子或熒光標(biāo)記結(jié)合的穩(wěn)定性好。適配體的這些獨(dú)特特性[70]，為快速高效的食源性致病菌現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

適配體的選擇過(guò)程稱(chēng)為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)，由兩個(gè)獨(dú)立的研究小組于 1990 年開(kāi)發(fā)[71-72]。SELEX 是適配體選擇的一個(gè)重要工具，為適配體和基于適配體技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。SELEX 過(guò)程包含多個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含4個(gè)步驟：(1)將寡核苷酸庫(kù)與目標(biāo)物孵育；(2)將與目標(biāo)物結(jié)合和未結(jié)合的核酸序列分離，并刪除未與目標(biāo)物結(jié)合的序列；(3)將與目標(biāo)物結(jié)合的序列用洗脫緩沖液洗脫下來(lái)；(4)將洗脫下來(lái)的序列作為后續(xù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物作為下一輪篩選的寡核苷酸庫(kù)，按上述步驟進(jìn)行多達(dá)20輪的篩選，直到獲得具有高靶親和力的適配體序列庫(kù)[73]，這些適配體可以被克隆并測(cè)序。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)隨機(jī)的寡核苷酸庫(kù)包含 40～100個(gè)單鏈核苷酸序列，每個(gè)序列的中間部分為隨機(jī)序列的核苷酸，兩端為固定序列。

SELEX 技術(shù)已被應(yīng)用于篩選致病菌的適配體。目前已有較多的常見(jiàn)致病菌篩選出核酸適配體，比如大腸桿菌[74]、副溶血弧菌[75]、鼠傷寒沙門(mén)氏菌[76]、單增李斯特菌[77]。與傳統(tǒng)的抗體生成過(guò)程相比，SELEX可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)有效地生成針對(duì)各種分析物的特異性核酸探針。更重要的是，所選擇的適配體的特殊性質(zhì)，如易于規(guī)模合成、易于修飾和長(zhǎng)期穩(wěn)定性等，使適配體成為傳統(tǒng)抗體的理想替代品。

1.5.1 納米金適配體技術(shù)納米金適配體技術(shù)是核酸適配體與納米金技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建的高靈敏度、高特異性的快速檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)目標(biāo)菌存在時(shí)，適配體作為識(shí)別與捕獲因子特異性地結(jié)合目標(biāo)菌，并引起納米金狀態(tài)發(fā)生改變?；跔顟B(tài)變化，可對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行定性與定量分析。

Jia等[78]將銅綠假單胞菌的適配體與超順磁性氧化鐵納米粒子共價(jià)結(jié)合，通過(guò)在加入目標(biāo)菌后測(cè)量自旋-自旋弛豫間(T2)的增加對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。該法已應(yīng)用于雞肉與飲用水樣品中銅綠假單胞菌的檢測(cè)，檢測(cè)可在40 min內(nèi)完成，檢測(cè)限為50 CFU/mL。Chen等[79]利用雙適配體修飾的牛血清蛋白可穩(wěn)定金納米團(tuán)簇并增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)過(guò)氧化物酶類(lèi)的活性，開(kāi)發(fā)了一種快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，最低檢出限達(dá)1 CFU/mL。Li等[80]提出了一種新的表面增強(qiáng)拉曼散射響應(yīng)方法，該法基于適配體、互補(bǔ)DNA、對(duì)氨基噻吩(PATP)和金納米棒對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)。在最優(yōu)條件下，表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)與鼠傷寒沙門(mén)氏菌濃度在56～56×107CFU/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)，檢出限為9 CFU/mL。

1.5.2 熒光適配體技術(shù)熒光適配體技術(shù)是將核酸適配體與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，基于適配體與相應(yīng)食源性致病菌作用后發(fā)生的熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)食源性致病菌。利用熒光基團(tuán)或猝滅基團(tuán)修飾適配體，加入目標(biāo)菌后，適配體構(gòu)象發(fā)生的改變可引起熒光信號(hào)的變化。

Jiang等[81]基于金屬有機(jī)骨架材料的熒光猝滅特性以及對(duì)核酸適配體的吸附性，結(jié)合核酸適配體的高親和力與高特異性識(shí)別能力，構(gòu)建了特異性識(shí)別沙門(mén)氏菌的新方法，熒光信號(hào)與沙門(mén)氏菌濃度的對(duì)數(shù)在101～105CFU/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢出限為7 CFU/mL。Maeng等[82]根據(jù)RNA適配體熒光強(qiáng)度的變化，開(kāi)發(fā)了金黃色葡萄球菌等致病菌的檢測(cè)系統(tǒng)，將篩選出的RNA適配體通過(guò)硫醇基團(tuán)固定在銀膜上，RNA適配體捕獲的細(xì)菌可通過(guò)添加適配體和攜帶有熒光素基團(tuán)的胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dT-FAM)的復(fù)合物后導(dǎo)致的熒光發(fā)射量的增加而被檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)捷、快速、特異性強(qiáng)。Huang等[83]通過(guò)磁選技術(shù)的12輪篩選，在體外獲得了親和度高、選擇性好的可與金黃色葡萄球菌腸毒素A結(jié)合的核酸適配體，用于食品樣品中金黃色葡萄球菌的腸毒素A的檢測(cè)，檢出限為8.7×10-3μg/mL。

1.5.3 電化學(xué)適配體技術(shù)電化學(xué)適配體技術(shù)通過(guò)將核酸適配體與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合，使適配體與電化學(xué)活性傳感元件固定在電極上。有目標(biāo)菌存在時(shí)，適配體與目標(biāo)菌結(jié)合導(dǎo)致電極表面修飾物結(jié)構(gòu)改變，可通過(guò)檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)或電流變化進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。

Luo等[84]建立了檢測(cè)大腸桿菌O111的電化學(xué)適配體生物傳感器技術(shù)，先將捕獲探針通過(guò)Au-硫醇錨定在電極表面上，適配體因與捕獲探針雜交被固定在金電極表面，當(dāng)目標(biāo)菌存在時(shí)，適配體會(huì)識(shí)別、結(jié)合目標(biāo)菌并脫離捕獲探針，捕獲探針與標(biāo)記生物素的檢測(cè)探針結(jié)合后留在電極表面，并在加入識(shí)別元件鏈霉抗堿性磷酸酶后產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。該技術(shù)可在3.5 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)致病菌的精確定量，對(duì)牛奶樣品中目標(biāo)菌的檢測(cè)限為305 CFU/mL，是一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、靈敏、快速的檢測(cè)技術(shù)。Abbaspour等[85]設(shè)計(jì)了一種基于雙適配體的電化學(xué)夾心傳感器測(cè)定法檢測(cè)金黃色葡萄球菌，該方法通過(guò)固定在磁珠表面上的初級(jí)適配體捕獲金黃色葡萄球菌，而與銀納米顆粒綴合的次級(jí)適配體可提供限定的電化學(xué)特性，顯著提高了檢測(cè)靈敏度，應(yīng)用釋放的Ag+離子進(jìn)行差示脈沖陽(yáng)極溶出伏安(DPV)信號(hào)的測(cè)量，實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的定性與定量檢測(cè)。該方法靈敏度高，為采用適配體常規(guī)檢測(cè)方法無(wú)法檢測(cè)的微量細(xì)菌的檢測(cè)提供了新方法。

2 食源性致病菌快速檢測(cè)方法存在的問(wèn)題及展望

近年來(lái)，多學(xué)科和各種技術(shù)的交匯發(fā)展、食品檢驗(yàn)體量的增加、各種會(huì)議保障的需求等因素，促進(jìn)了食源性致病菌快速檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。但是各種食源性致病菌快速檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：免疫學(xué)方法成本低、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度有待提高，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性；分子生物學(xué)技術(shù)雖然快速高效，但存在價(jià)格昂貴，基因測(cè)序還不完全等不足；代謝學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但需要大量的數(shù)據(jù)支撐，易受環(huán)境因素的影響；生物傳感器和核酸適配體技術(shù)具有較強(qiáng)的特異性和選擇性?？偟膩?lái)說(shuō)，食源性致病菌快速檢測(cè)方法具有特異性高、靈敏度高、成本低，對(duì)操作人員及環(huán)境和儀器要求低，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，適合大量樣品的快速篩查，能將食品安全問(wèn)題遏制在進(jìn)入消費(fèi)者餐桌的前端，是保障食品安全和防控食源性致病菌感染的重要技術(shù)支撐。

各種技術(shù)的改進(jìn)和創(chuàng)新提高了快速檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性，解決了部分專(zhuān)業(yè)局限性的問(wèn)題，為食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了機(jī)遇。如分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展帶來(lái)的高通量及絕對(duì)定量的檢測(cè)分析技術(shù)，以蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用及膠體金技術(shù)與多學(xué)科的結(jié)合等，這些技術(shù)雖然還存在各方面的不足，需要進(jìn)一步的改進(jìn)和拓展，但在未來(lái)，隨著生物傳感器技術(shù)、核酸適配體技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等各種檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏度將逐步提高，檢測(cè)成本將逐步降低，并最終應(yīng)用于日常檢測(cè)監(jiān)管中，不斷提高人們的食品安全等級(jí)。