非洲豬瘟病毒檢測方法的研究進展

楊湛森，蔣雅楠，程 楠，李相陽，黃昆侖， 劉清亮，孫艷麗，許文濤*

(1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.北京農學院 食品科學與工程學院，北京 102206；3.山東拜爾檢測股份有限公司，山東 濰坊 261061)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種影響各個品種與年齡段豬的毀滅性傳染病[1]，其特征包括高燒，皮膚發紺，淋巴嚴重出血，死亡率高達100%，被世界動物衛生組織(International Epizootic Office，OIE)列為必須及時通報的動物疫病，對養豬產業構成了巨大威脅，我國也將其列為主要的外來動物疾病[2-3]。非洲豬瘟是由雙鏈DNA蟲媒病毒——非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的，它是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[2,4]，具有復雜的二十面體結構，直徑約200 nm，基因組大小在170～190 kb范圍之間[5]。非洲豬瘟病毒首次報道于1921年的肯尼亞[6]，在20世紀中葉于歐洲、南美爆發，90年代在歐洲大部分地區被消滅后仍流行于意大利撒丁島[7]。2007年，非洲豬瘟首次進入俄羅斯高加索地區格魯尼亞，并傳播到烏克蘭(2012)、白俄羅斯(2013)、立陶宛(2014)、愛沙尼亞(2014)、波蘭(2014)、拉脫維亞(2014)、羅馬尼亞(2017)、捷克共和國(2017)和匈牙利(2017)等東歐其他國家，2018年在我國沈陽發現首例非洲豬瘟病毒疫情報道[6]。2019年的越南同樣爆發了非洲豬瘟疫情[8]。2020年以來，全球共有26個國家和地區發生了2 300起家豬和7 437起野豬共9 737起非洲豬瘟疫情[9],對全球養豬業構成了巨大威脅，造成了巨額經濟損失[10]。

目前，尚未有針對非洲豬瘟病毒的特效藥和疫苗，其主要的防控策略依靠衛生措施的實施以及對感染或暴露動物的屠宰[11]。因此，非洲豬瘟病毒的檢測與早期診斷對于疫情確認和控制至關重要。世界動物衛生組織建議的非洲豬瘟病毒檢測方法包括病毒分離、熒光抗體檢測以及實時和常規聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)檢測[12]。本文根據非洲豬瘟病毒的檢測原理將其檢測方法分為病毒分離方法、免疫學檢測方法與分子學檢測方法，對各方法的原理和特點進行簡單介紹，并對非洲豬瘟病毒檢測的研究進展進行了綜述。

1 病毒分離法檢測非洲豬瘟病毒

1960年，Malmquist等[13]開發了病毒分離法即紅細胞吸附試驗(Haemadsorption test，HAD test)，其原理是豬紅細胞會吸附在感染非洲豬瘟病毒的豬單核細胞或巨噬細胞的表面，這些細胞可從豬血液、肝臟、脾臟、淋巴結和扁桃體等組織器官中分離[14]。HAD試驗的陽性結果對非洲豬瘟的診斷是決定性的，是非洲豬瘟病毒的特異性反應，但該方法也存在一些缺陷，包括：對于試驗要求的技術手段較高，陰性診斷由于原代細胞培養的緣故費時費力，部分非洲豬瘟病毒沒有紅細胞吸附現象存在假陰性，因此通常作為其他方法的參考與補充參與非洲豬瘟病毒的檢測。

2 免疫學方法檢測非洲豬瘟病毒

免疫學檢測方法可根據檢測靶標的不同分為抗原檢測與抗體檢測，其中因非洲豬瘟病毒抗體在被感染后的幾個月或幾年中依舊存在，因此可依此發現幸存的感染動物[15]。免疫學檢測方法根據檢測手段可分為免疫熒光試驗、免疫印跡試驗、酶聯免疫吸附試驗與免疫層析試紙等。目前，在非洲豬瘟病毒的54個結構蛋白中，有19個蛋白的編碼基因是已知的，除此之外，非洲豬瘟病毒也有一些非結構蛋白，這些蛋白在滿足要求的情況下可作為免疫學方法檢測的靶標[16-18]，非洲豬瘟病毒蛋白與其編碼基因信息見表1。

表1 非洲豬瘟病毒蛋白與其編碼基因Table 1 Proteins of ASFV and these coding genes

2.1 免疫熒光試驗

免疫熒光試驗可分為熒光抗體試驗(Fluorescent antibody test，FAT)與間接熒光抗體試驗(Indirect fluorescent antibody test，IFAT)，其區別在于檢測靶標是非洲豬瘟病毒抗原還是因其產生的抗體。熒光抗體試驗原理是利用熒光標記的抗體與抗原形成抗原抗體復合物顆粒，再通過顯微鏡檢測，該方法可用來檢測感染非洲豬瘟病毒的豬組織涂片或切片中的病毒抗原。間接熒光抗體試驗是利用熒光標記的非洲豬瘟病毒二抗檢測樣品中因抗原產生的抗體，如Heuschele等[19]利用免疫熒光試驗實現了對不產生紅細胞吸附的非洲豬瘟病毒的檢測。

2.2 免疫印跡試驗

免疫印跡試驗(Immunoblotting test)的原理是將凝膠電泳分離后的蛋白固定于印跡紙上，通過類似于免疫熒光試驗的直接或間接方法，實現對非洲豬瘟抗原或抗體的檢測，其信號由熒光或酶促反應產生。免疫印跡試驗具有高通量、敏感度高、特異性強等優點，但其對試驗條件與儀器設備有較高要求。Barderas等[20]利用粉紋夜蛾(Trichoplusiani)幼蟲制備了非洲豬瘟病毒重組蛋白p30，并通過實驗優化確定25 μg總幼蟲蛋白提取物固定到硝酸纖維素條上時可得到最優結果，且在進行正常豬血清測試時得到了陰性結果。Sakamoto等[21]利用昆蟲細胞表達了非洲豬瘟重組蛋白p32和p54，在5種抗病毒血清的測試中得到了陽性結果，在正常豬血清測試中得到了陰性結果。Kazakova等[22]制備了高純度重組蛋白p30，開發了基于高純度重組蛋白p30的免疫印跡檢測系統，對家豬和野豬或自然性感染非洲豬瘟病毒的血清和器官樣本進行測試，方法的特異性和敏感性分別為98.75%與100.00%，其高靈敏度使得該方法可檢出感染非洲豬瘟病毒6～8 d的病豬免疫器官或血清中的非洲豬瘟病毒特異性抗體。

2.3 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的基本原理是通過與酶分子共價結合的抗體與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性反應，在有底物溶液存在的情況下，酶分子催化發生顏色反應，由于檢測方法的不同(直接ELISA、雙夾心ELISA、間接ELISA等)，靶標濃度與顏色深淺呈不同關系。如Barderas等[20]和Sakamoto等[21]同樣利用制備的重組蛋白p30(p32)和p54進行間接ELISA，確認了這幾種重組蛋白在針對非洲豬瘟病毒產生的特異性抗體檢測中的潛力。Perez-Filgueira等[23]利用重組蛋白p30開發的ELISA方法對來自西班牙的樣本檢測結果顯示出相似于傳統ELISA的靈敏度和更高的特異性，且對實驗動物感染的早期檢測也呈現更高的靈敏度，對比來自西班牙和非洲的樣本，其抗原性的變異會影響基于重組蛋白p30的ELISA檢測，但這種方法仍是一種可用于發展中國家非洲豬瘟檢測的廉價可行策略。Hutchings等[24]開發了兩種間接夾心ELISA法檢測非洲豬瘟病毒抗原：一種是利用兔和豚鼠培養的抗細胞質可溶性非洲豬瘟蛋白的多克隆血清；另一種是利用非洲豬瘟VP73蛋白的單克隆抗體與兔多克隆血清，這兩種方法均能檢出具有代表性的、系統遺傳學上不同的非洲豬瘟病毒抗原，但使用多克隆血清時的靈敏度更高。Cubillos等[25]同樣利用從東非分離株分離出的重組蛋白p30進行了ELISA試驗，發現基于該重組蛋白p30的ELISA能夠準確檢出非洲豬瘟病毒。Giménez-Lirola等[26]通過對比p30、p54與p72 3種重組蛋白，最終選擇重組蛋白p30為基礎構建間接雙夾心ELISA法，該方法能夠完成豬血清和口腔液中非洲豬瘟病毒特異性抗體的檢測。除此之外，商品化的ELISA試劑盒和傳統ELISA也被廣泛應用于非洲豬瘟病毒的檢測[27-29]。

2.4 免疫層析試紙

隨著納米粒子與顯色手段的發展，免疫層析試紙已不局限于膠體金試紙。免疫層析試紙的夾心法原理是形成顯色粒子抗體-抗原復合物后，被檢測線處抗體捕獲；其競爭法原理是影響陰性條件下檢測線處顯色復合物的形成。檢測線在靶標存在與否時呈現顯色或不顯色的情況，質控線是為了確認試紙能夠正常檢測而存在，一般能夠直接捕獲顯色粒子標記的抗體而顯色。最近幾年關于免疫試紙的研究主要集中于多重檢測和其他檢測信號的開發。Sastre等[2]通過不同顏色的羧基化乳膠微球，基于非洲豬瘟病毒衣殼蛋白VP72與經典豬瘟病毒(Classic swine fever virus，CSFV)結構蛋白E2構建了可同時檢測非洲豬瘟病毒特異性抗體和經典豬瘟病毒特異性抗體的雙重試紙，發現其在這兩種疾病診斷方面具有潛力。Sastre等[30]開發了一種基于非洲豬瘟病毒衣殼蛋白VP72單克隆抗體的抗原檢測免疫層析試紙，利用黑色和藍色的羧基化乳膠微球分別進行檢測和質控，該免疫層析試紙在實驗感染樣本檢測中具有和抗原ELISA很好的相關性，但不如PCR，在實際樣品檢測中則略優于ELISA，特異性接近100%。Li等[31]利用重組蛋白p54與含銪熒光微球構建了檢測非洲豬瘟抗體的快速檢測方法，最佳檢測條件下可在20 min內僅需75 μL血清即可檢出靶標，具有較高特異性，檢測結果與ELISA試劑盒一致，準確性和可重復性高，成本低，適用于我國非洲豬瘟病毒的檢測。

2.5 其他免疫學檢測方法

Abad等[32]設計了一種壓電石英晶體微平衡(Quartz crystal microbalance，QCM)生物傳感器用于檢測非洲豬瘟病毒附著蛋白p12的抗體，可在30 min內檢出結果，性能優于ELISA，但沒有ELISA的高通量優勢。其原理是利用抗原抗體的結合反應，引起質量敏感的壓電晶體共振頻率的變化，通過對這種變化的檢測實現對非洲豬瘟病毒的檢測。類似的，Uttenthaler等[33]通過壓電石英晶體微平衡設計了一種直接壓電注射免疫分析法用于非洲豬瘟病毒特異性多肽單克隆抗體18BG3和病毒蛋白VP73的檢測。

Luminex懸浮芯片技術(Suspension array technology，SAT)也稱xMAP(Flexible multiple-analyte profiling)，其原理是以不同比例熒光標記聚苯乙烯微球和磁性微球偶聯蛋白、核酸等分子，與靶標結合后由流式細胞儀檢測。Aira等[34]利用xMAP技術開發了同時檢測非洲豬瘟病毒的特異性蛋白VP72的抗體、VP30的抗體和經典豬瘟病毒的特異性蛋白E2的抗體的檢測方法，靈敏度優于ELISA。

Szeredi等[35]使用一種商業化小鼠單克隆抗體(Clone 1BC11)，在細胞培養中利用免疫細胞化學(Immunocytochemical，IC)方法，在組織樣本中利用免疫組織化學(Immunohistochemical，IHC)方法對非洲豬瘟病毒衣殼蛋白p72進行檢測，證明了這兩種方法在非洲豬瘟研究和診斷中是可以使用的輔助性實驗室檢測方法，其原理類似于免疫熒光試驗，區別在于將熒光標記信號改變為染色信號。

3 分子學方法檢測非洲豬瘟病毒

ASFV全基因組大小在170～190 kb之間，具有數量在151～167之間的開放閱讀框架[5,17]，進行分子學檢測首先需尋找非洲豬瘟病毒基因組中足夠保守又區別于其他進化關系比較近的病毒序列，因此分子學檢測方法有必要對此進行驗證，以確保該方法可檢測到所有流行的非洲豬瘟病毒，且不會因為其他關系較近病毒而發生誤判，非洲豬瘟病毒中編碼蛋白的部分基因見表1。分子生物學檢測方法主要包括聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)、等溫擴增技術(Isothermal amplification techniques)、成簇規律間隔的短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統等。

3.1 聚合酶鏈式反應

PCR是利用雙鏈擴增的原理，在引物、酶、4種脫氧核糖核苷酸存在的情況下，在生物體外對特定的DNA片段進行指數擴增，得到該片段的大量拷貝。PCR是一種常用的非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法，也是最為常見的實驗室分子生物學診斷方法之一。Agüero等[36]基于VP73基因提供了一種高靈敏的熱啟動PCR檢測方法，可用于非洲豬瘟檢測的常規實驗。Basto等[37]利用巢式PCR檢測了游走鳥壁虱體內的非洲豬瘟病毒，相較于病毒分離法與普通PCR法，該方法具有更好的敏感性，其引物來自于非洲豬瘟VP72基因。Giammarioli等[38]建立了一種能夠同時檢測經典豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬細小病病毒(Porcine parvovirus，PPV)的多重熱啟動PCR檢測方法，該方法需先進行一步逆轉錄，其性能可滿足常規分子診斷需要。Luka等[39]從福爾馬林中的固定和非固定組織中進行DNA提取，然后進行PCR，證明了利用傳統方法提取這些樣品的DNA反應效果更好。Peng等[40]建立了可同時檢測非洲豬瘟病毒和豬水皰病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)的雙重PCR反應，其中檢測非洲豬瘟病毒的引物是針對p72蛋白的基因設計的。Luo等[11]針對非洲豬瘟病毒VP72基因開發了一種新型PCR方法，該方法通過重新設計通用引物，使得該方法相較于OIE推薦的常規PCR方法在檢測部分基因型的ASFV時具有更高的靈敏度。Erickson等[41]利用多重反轉錄PCR與自動電子芯片檢測了包括非洲豬瘟病毒、經典豬瘟病毒、豬水皰病病毒、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、豬水皰疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus，VESV) 7種豬病毒，其中非洲豬瘟病毒的檢測限為10 copies/μL。Xiao等[42]構建了基于懸浮陣列系統的多重PCR檢測非洲豬瘟病毒、經典豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬細小病毒、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV) 7種豬病毒，檢出限為1 000 copies/μL，在豬相關病毒的檢測中是一種具有潛力的方法。Zeng等[43]將PCR方法與側流試紙結合，實現了非洲豬瘟病毒的快速檢測，該方法與經過OIE驗證的實時PCR方法符合率為89.67%，Kappa值為0.763(p<0.001)，與商用試劑盒的符合率為97.67%，Kappa值為0.950(p<0.001),表明該方法適用于非洲豬瘟病毒的現場檢測。

實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是利用熒光染料或熒光標記的特異性探針標記跟蹤PCR擴增產物，將PCR與光譜結合的核酸定量檢測技術，具有靈敏度高、特異性好、閉管操作污染小、可定量與避免電泳污染等優點。King等[44]建立的基于非洲豬瘟病毒VP72基因的快速檢測非洲豬瘟病毒的閉管PCR方法，首次將實時熒光定量PCR應用于非洲豬瘟的檢測，并成為被OIE推薦的非洲豬瘟病毒檢測方法。作為一種極有價值的疑似病例鑒別分子學方法，實時熒光定量PCR研究一直是較為熱門的方向(表2)。Ronish等[45]通過大量擴增的非洲豬瘟病毒VP72基因的指數后線性PCR(Linear-after-the-exponential-PCR，LATE-PCR)建立了一種熒光信號讀取于PCR擴增終點的新型檢測方法，該方法是區別于RTPCR的熒光定量PCR方法，檢測限可達1 copie。

表2 利用實時熒光定量PCR檢測非洲豬瘟病毒的研究Table 2 The research of the detection of ASFV use RTFQ PCR

3.2 等溫擴增技術

相較于PCR技術而言，等溫擴增技術無需專業熱循環儀，更適用于現場檢測與非實驗室的環境下檢測。目前，已開發出包括環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴增技術(Cross priming amplification，CPA)、多重交叉替代擴增技術(Multiple cross displacement amplification，MCDA)、滾環擴增技術(Rolling circle amplification，RCA)、重組聚合酶擴增技術(Recombinase protein amplification，RPA)、重組聚合酶輔助擴增技術(Recombinase-aided amplification，RAA)、解旋酶依賴擴增技術(Helicase-dependent amplification，HDA)、雜交鏈式反應(Hybridization chain reaction，HCR)、指數擴增技術(Exponential amplification reaction，EXPAR)等多種等溫擴增技術。本課題組在等溫擴增技術應用于各種靶標的檢測方法開發領域也進行了一定工作，包括利用RPA和LAMP對食品病原體和轉基因食品進行檢測[56-59]、利用HCR對脂多糖進行檢測[60]、利用EXPAR對microRNA進行檢測[61]等。

3.3 CRISPR/Cas系統

CRISPR即成簇規律間隔的短回文重復序列，又稱常間回文重復序列叢集，是原核生物基因組內的一段重復序列。CRISPR/Cas系統是原核生物的“免疫系統”，利用CRISPR序列中來自于攻擊過該生物的病毒基因片段結合外來核酸片段，啟動CRISPR相關聯蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)對外來核酸片段進行摧毀，保護自身核酸。根據這一系統的原理，可對非洲豬瘟病毒進行檢測，該方法靈敏度極高。利用CRISPR/Cas系統對于非洲豬瘟病毒檢測的研究在最近是非常熱門的方向，如表3所示。

表3 利用CRISPR/Cas系統檢測非洲豬瘟病毒的研究Table 3 The research of the detection of ASFV use CRISPR/Cas system

(續表3)

Sequence numberTargetDetection principleLODReference9p72After the CRISPR/Cas12a system was used to simultaneously cleave the RAA amplicon and the FAM-Biotin ssDNA reporter,the AuNPs-anti FAM antibody conjugates can through the control line to the test line form a red band(利用CRISPR/Cas12a系統同時裂解RAA擴增子與FAM和生物素雙標記的ssDNA報告分子后,金納米FAM抗體共軛物可以通過質控線在檢測線形成紅色條帶)6×105 copies/mL[82]10VP72After the CRISPR/Cas12a system was used to simultaneously cleave the PCR amplicon or RPA amplicon and the ssDNA,the AuNPs-DNA probes conjugates lose the linker and turn to red(利用CRISPR/Cas12a系統同時裂解PCR擴增子或RPA擴增子和ss-DNA后,金納米DNA探針共軛物失去連接子,變為紅色)200 copies[83]

3.4 其他分子學檢測方法

原位雜交技術(In situ hybridisation，ISH)是利用核酸堿基互補配對的原理，使被標記的外來核酸探針和被固定好的樣本內的核酸結合，根據標記采用不同的檢測手段，使該核酸在樣本中的位置顯現的方法。Ballester等[84]開發了一種新的原位雜交技術，設計了3種探針：p30、p54、p72 3種結構蛋白基因互補的3種寡聚核苷酸鏈(40nt)、Ba71L基因組的18.5 kb片段、E75L全基因組，其中后兩種探針經地高辛標記后均可用于福爾馬林固定和石蠟包埋中的組織細胞的原位雜交。

光在由光密介質進入光疏介質發生全反射時，入射光會透過光疏介質一個波長距離的深度后再沿界面流動半個波長距離后返回光密介質，這段透過光疏介質的波被稱為倏逝波。表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)現象是光在棱鏡與金屬膜表面發生全反射時，倏逝波與金屬中存在的離子波若發生共振，導致入射光的能量被離子波吸收，使反射光能量減弱。Biagetti等[85]建立了基于表面等離子共振原理的生物傳感器，利用固定核酸(Locked nucleic acid nucleotides，LNA)代替單鏈核酸作為VP72基因保守區域的互補原件構建了倏逝波/共振鏡(Evanescent wave/resonant mirror)光學生物傳感器，固定核酸與靶標雙鏈形成三核酸結構后，質量發生改變導致折射指數發生改變進而被檢測出來，其檢測限與定量限為178 copies與245 copies。

4 總結與展望

近年來，非洲豬瘟病毒在全球范圍內依舊是養豬業的重大威脅，其檢測方法的研究進展對于非洲豬瘟病毒早期診斷至關重要，對疫情確認和控制具有重要意義。本文所提到的非洲豬瘟病毒檢測方法的檢測能力與適用場景尚存在一定不足(表4)，針對這些存在的問題，非洲豬瘟病毒的檢測方法應用需在保證靈敏度和特異性的情況下，提高其檢測限與現場即時診斷能力，未來關于非洲豬瘟病毒的研究應集中于低成本、工業化、高通量、高性能等方向，分子學檢測方法在提高非洲豬瘟病毒的檢測性能方面十分有效，將分子學檢測方法與目前已經實現產業化生產的試紙、試劑盒、微流控等相結合可以降低成本、提高檢測通量。

表4 非洲豬瘟病毒檢測方法匯總表Table 4 The summary sheet of african swine fever detection methods

(續表4)

Sequence numberMethodsAdvantagesLimitation5Polymerase chain reaction(聚合酶鏈式反應)Convenient operation,high specificity and sensitivity(操作方便、特異性好、靈敏度高)Need prefessional themal cycler,high-demand of instrument(需專業熱循環儀,儀器設備要求高)6Isothermal amplification techniques(等溫擴增技術)No prefessional themal cycler,suitable for field detection(無需專業熱循環儀,適于現場檢測)Aerosol contamination,false positive(氣溶膠、假陽性)7CRISPR/Cas systemUltra high sensitivity(超高靈敏度)Need preamplication of nucleic acid,complex system(需核酸預擴增,體系復雜)