基于電化學傳感器檢測赭曲霉毒素A的研究進展

李林芝，何賽君，黃添增，劉 星,3,4,5，陳 奇,3,4,5， 陳 健,3,4,5，曹宏梅,3,4,5*

(1.海南大學 食品科學與工程學院,海南 海口 570228；2.海南大學 化學與工程技術學院,海南 海口 570228；3.海南省食品營養與功能食品重點實驗室,海南 海口 570228；4.熱帶多糖資源利用教育部工程 研究中心,海南 海口 570228；5.海南省南海水產資源高效利用工程研究中心,海南 海口 570228)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是一種由赭曲霉、青霉菌等真菌產生的次級代謝產物，廣泛存在于糧谷類、飼料、堅果、葡萄及葡萄酒、咖啡及其制品中[1]。雖然OTA在食品中的含量極少，但其能長期在人體和動物體中積累，不僅對肝臟、腎臟損害極大，還對神經系統和免疫系統具有毒性，可能致畸和致癌[2]。

OTA具有的廣泛毒性引起了國內外的關注。1993年，國際癌癥研究中心將OTA認定為ⅡB類致癌物[3]。隨后，歐盟、美國等[4]國家針對OTA在不同食品中的含量制定了限量標準，如直接使用谷物加工品中OTA限量標準為3.0 μg/kg，未經加工谷物為5.0 μg/kg，葡萄酒為2.0 μg/kg。我國針對谷物、豆類、辣椒及其制品等也規定了嚴格的OTA限量標準，其中谷物及加工品、豆類中OTA限量為5.0 μg/kg。2017年，我國增加了對葡萄酒和咖啡中OTA的限量指標[5-6]，其中葡萄酒為2.0 μg/kg，咖啡豆和咖啡粉為 5.0 μg/kg，速溶咖啡為10.0 μg/kg。同時，GB 5009.96-2016規定了食品中OTA的標準檢測方法，并針對不同檢測方法規定了檢出限或定量下限[6]。因此，食品中OTA含量的檢測對保障人民身體健康具有重要意義。

目前已有較成熟的OTA檢測方法，如薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、酶聯免疫吸附技術[9]、時間分辨熒光免疫分析技術[10]、膠體金免疫層析技術[11]、化學發光酶免疫分析技術[12]等。其中，薄層色譜法和膠體金免疫層析技術方法簡單,所用試劑廉價，但靈敏度低；高效液相色譜法的靈敏度高、重現性好，但成本高、操作過程復雜；酶聯免疫吸附技術操作簡單，但靈敏度低。而電化學傳感作為快速發展的新檢測方法，具有靈敏度高、穩定性好、檢測范圍廣、快速、便攜等優點，為OTA的定性、定量快速檢測提供了新的發展方向。近年來，研究者們開發了大量靈敏度高、穩定性好、檢測范圍寬的新型OTA電化學傳感器，且廣泛應用于谷物[13]、葡萄[14]、咖啡[15]等實際樣品中OTA含量的檢測。本文綜述了近年來電化學傳感在OTA檢測方面的研究進展及在食品安全領域中的應用，為后期OTA電化學傳感在快速檢測領域的發展提供了一定參考。

1 OTA電化學傳感的原理及分類

近年來，利用電化學傳感在OTA檢測方面得到了快速發展，其檢測原理是基于識別分子和目標物之間在電極表面發生氧化還原反應所產生電流的變化進行分析[16]。因此，電化學傳感兼具化學反應和電化學傳導的優勢，如高特異性、強親和力、高靈敏性和反應性。此外，電化學傳感還具有易便攜、微型化、消耗試劑少、無需復雜前處理等優點[17]。因此，結合OTA的特征和現代檢測技術的要求，電化學傳感已成為目前分析OTA濃度的潛在方法。信號識別分子是電化學傳感的重要組成部分，根據OTA目標物信號識別分子不同，例如適配體[18]、抗體[17-18]、分子印跡聚合物[19]，OTA電化學傳感主要可以分為三類，即基于核酸適配體的電化學傳感、基于抗原-抗體的免疫電化學傳感和基于分子印跡的電化學傳感。本文將從此三方面具體介紹OTA電化學傳感的發展及其在食品安全領域中的應用。

2 基于核酸適配體的OTA電化學傳感及其應用

適配體是一種單鏈DNA或RNA核酸片段，含有10～50個可變堿基序列，能特異性識別目標物，如蛋白質、核酸、毒素、細胞、細菌等。通過配體的系統進化指數富集技術可篩選合適的適配體序列，從含有不同序列的大型文庫中對寡核苷酸進行多次的選擇和擴增。2008年,Cruz-Aguado和Penner[20]首次通過配體的系統進化指數富集技術分離出OTA適配體序列。適配體作為電化學傳感器構建中的高效識別分子，具有生產成本低、容易修飾、穩定性好、親和力強、特異性高等優勢，因此，基于OTA適配體的電化學傳感器成為近幾年的研究熱點。 表1總結了近5年基于OTA適配體的電化學傳感方法快速檢測OTA的研究工作。從表中可以看出，除了在電極表面直接連接OTA適配體[21-30]，不同類型的納米材料也越來越多地應用于OTA適配體傳感器的構建。例如具有良好導電性的納米金顆粒可直接電鍍到電極表面形成金層，或使用導電性好的銀離子，以起到信號放大的效果[31-38]。還有研究者將金納米粒子與其他金屬粒子結合，構建更靈敏的OTA電化學適配體傳感器[39-44]。除了金屬納米材料，碳納米材料(如石墨烯、碳納米管、碳氣凝膠)[45-52]和有機納米材料(如聚苯乙烯)也應用到OTA適配體傳感器的構建[53-55]，以改進傳感器的靈敏度與穩定性。上述基于納米材料構建的OTA適配體傳感中，根據應用的電化學技術不同，可分為電流型OTA適配體電化學傳感和電阻型OTA適配體電化學傳感。

表1 基于適配體的OTA電化學傳感Table 1 Electrochemical sensors based on OTA aptamer

2.1 電流型OTA適配體電化學傳感

電流型電化學傳感是基于工作電極在含有電活性物質的溶液中產生電流，通過峰電位的位置識別作用靶點，并通過峰電位的數值變化表征電化學傳感器的性能。目前該技術已經成為一種強大的電化學生物傳感技術，常用的伏安技術有差分脈沖伏安法(DPV)、循環伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)。

基于納米材料的電流型OTA適配體傳感主要利用DPV、CV和SWV 3種技術進行檢測。根據檢測目標物(OTA)引起的電流信號變化，可進一步細分為電流降低型OTA適配體電化學傳感和電流增大型OTA適配體電化學傳感。如基于單一貴金屬納米粒子(Au、Pt、Ag)[31,33,36,38]及雙金屬納米粒子[39,42,44]構建的電流降低型OTA適配體電化學傳感。由于雙金屬的協同作用，基于雙金屬納米粒子構建傳感器表現出更高的電催化活性。同時，有研究者利用雙金屬納米粒子與金屬有機物結合，構建了高靈敏的電流型OTA適配體傳感。如Zhang等[39]在鐵卟啉金屬有機骨架上原位沉積AgPt雙金屬納米粒子，形成了金屬有機聚合物作為探針分子的電流降低型OTA適配體傳感(圖1A)。當無OTA時，通過鏈霉親和素和生物素作用，AgPt/PCN-223-Fe結合OTA適配體，產生強氧化還原電化學信號，導致DPV峰電流增加，但當OTA存在時，適配體更易結合OTA，使得DPV峰電流值降低。此傳感器的檢出限可低至14 fg/mL，已成功應用于紅酒和玉米樣品中OTA含量的檢測。隨著石墨烯材料的廣泛開發，氧化石墨烯材料由于穩定性強和能夠促進電子轉移，因此成為理想的構建OTA電化學傳感器的界面材料。Prabhakar等[46]基于石墨烯摻雜殼聚糖復合物構建電流降低型適配體傳感(如圖1B)，由于石墨烯能增加電極的活性比表面積，而殼聚糖能阻止適配體的泄漏，此傳感已成功應用于葡萄汁中OTA含量的分析，檢出限可達 1 fg/mL。

圖1 電流型OTA適配體傳感器的構建Fig.1 Fabrication of OTA aptasensing based the change of current A.current reduction adaptor sensing based AgPt bimetallic nanoparticles decorated iron-porphyrinic metal-organic framework(基于 AgPt雙金屬負載金屬有機物的電流降低型OTA適配體傳感);B.current reduction adaptor sensing based on graphene doped chitosan nanocomposites(基于石墨烯摻雜殼聚糖復合物的電流降低型OTA適配體傳感);C.current amplification OTA aptamer sensing based on exonuclease I-assisted silver-metallized(基于核酸外切酶- 輔助的銀金屬化電流增大型OTA適配體傳感);D.current amplification OTA aptamer sensing based on graphene oxide nanosheets and DNase I-based target recycling reaction (基于氧化石墨烯納米片-硫堇的信號放大型OTA適配體傳感)

相比電流降低型OTA適配體電化學傳感，電流增大型OTA適配體電化學傳感因具有降低背景信號干擾，提高分析靈敏度等優勢，近年來引起研究者的廣泛關注。deMello等[32]最近發展了一種核酸外切酶-輔助的銀金屬化電流增大型OTA適配體電化學傳感(如圖1C)，此傳感器以金屬銀作為信號增強器，利用核酸外切酶降解未結合適配體，可抑制背景信號，提高傳感器檢測靈敏度。該傳感器用于啤酒中OTA含量的檢測，檢出限為0.7 pg/mL。Sun等[51]也構建了基于氧化石墨烯的電流增大型OTA適配體傳感器，該傳感器由硫堇-核酸適體共軛組裝的氧化石墨烯納米片、脫氧核糖核酸酶I組成。在OTA存在下，脫氧核糖核酸酶I裂解為硫堇-適配體/目標分子復合物，通過監測硫菫分子的電流變化，可定量評估小麥樣品中OTA的濃度(如圖1D)。

2.2 電阻型OTA適配體電化學傳感

電阻型免疫電化學傳感器的建立是通過表征電化學阻抗值的變化。當工作電極表面修飾抗體、OTA等分子后，分子的阻擋作用使其表面的電子傳遞效率降低，從而導致阻抗值增大。近年來，研究者利用電化學阻抗技術構建了阻抗型OTA適配體電化學傳感。目前的研究中，大多為電阻增大型OTA適配體傳感，Bi等[34]以巰基化適體在金基底上的自組裝單分子膜為基礎，構建了無標記阻抗型OTA適配體傳感器。該方法成功地應用于白酒和葡萄汁中OTA的檢測，其檢出限為0.03 ng/mL，低于一步法硫酰化DNA適配傳感器。

除了以納米金為基底構建OTA適體傳感器，研究人員還著力于探究新的金屬材料在電化學中的應用，Zhou等[40]基于Cu-Co類普魯士藍立方體復合物耦合金納米粒子構建了阻抗型OTA適配體傳感(圖2A)。此雙金屬立方體復合物顯示了優良導電性，強適配體結合力，以及穩定四面體，可實現對果汁樣品中OTA濃度的定量分析，檢出限低至5.2 fg/mL。最近，Marty等[21]發展了基于廉價、高活性比表面積的鉛筆石墨檢測OTA的新型電化學阻抗型適配體傳感(圖2B)，其檢測范圍為 0.1～2.0 ng/mL，檢出限可達0.1 ng/mL，并成功應用于啤酒樣品中OTA的檢測。

圖2 電阻型OTA適配體傳感器的構建Fig.2 Fabrication of OTA impedimetric aptasensing A.based on the bimetallic(Cu-Co) prussian blue analogue loaded with gold nanoparticles(AuNP@CuCoPBA)(基于Cu-Co類 普魯士藍復合物載入金納米粒子);B.based on modified pencil graphite electrodes(基于鉛筆石墨)

3 基于抗原-抗體的OTA免疫電化學傳感及應用

免疫電化學傳感是基于抗原-抗體的特異性識別作用進行定性定量的分析方法。OTA是非免疫原性小分子，能與特異性抗體(如單克隆抗體、多克隆抗體、噬菌體模擬表位肽、納米抗體)進行結合。目前，基于免疫型電化學傳感器檢測OTA的研究相對較少，其中大多是基于金屬納米材料的良好性能而構建，表2總結了近10年基于抗原-抗體的電化學免疫傳感檢測OTA的研究[56-68]。根據應用的電化學技術的不同，免疫電化學傳感可分為電流型免疫電化學傳感和電阻型免疫電化學傳感。

表2 基于抗原-抗體的電化學免疫傳感檢測OTATable 2 Electrochemical immunoassay based on antigen-antibody for OTA detection

3.1 電流型OTA免疫電化學傳感

在已報道的電流型OTA免疫電化學傳感中，根據檢測策略不同，可分為直接檢測型[56-64]和競爭型[65-67]。Solanki等[57]報道了利用直接檢測策略構建電流型OTA免疫電化學傳感。其將殼聚糖碳化成氨基功能化的碳納米材料，同時原位生長氧化鋯納米粒子(nZrO2)，構建的傳感器顯示良好的性能，利用DPV技術對OTA直接進行特異性檢測，其檢出限為1 ng/mL，此傳感器被應用于咖啡樣品中OTA的定量分析(圖3A)。Bechelany等[68]發展了免標記型免疫電化學傳感直接檢測OTA，利用原子層沉積技術在碳氈電極表面負載Pd納米粒子，然后共價連接抗-OTA單克隆抗體，構建了BSA/anti-OTA/PdNPs/CF傳感。此傳感對稀釋咖啡樣品中的OTA顯示良好分析性能，檢出限可達 0.096 ng/mL。

Vidal等[65]發展了競爭型OTA電化學免疫傳感,OTA-BSA和OTA-BSA-AuNPs分別作為工作電極，連接多克隆抗OTA抗體構建兩種間接免疫傳感(圖3B)，結果顯示基于金納米結構的傳感具有更低的檢出限，此傳感器可應用于小麥中OTA含量的測定。盡管基于單克隆抗體、多克隆抗體構建的OTA免疫電化學傳感顯示了良好的性能，如高特異性、良好重現性、低檢出限等，但存在抗體之間交叉反應的不足。為了克服上述缺點，研究者們開發其他類型的OTA識別分子，如噬菌體模擬表位肽、納米抗體等。He等[66]利用噬菌體模擬表位肽構建了高靈敏的競爭型OTA電化學免疫傳感器(圖3C)，可忽略交叉反應的影響，所建免疫傳感器的檢出限為2.04 fg/mL，線性范圍為7.17～548.76 fg/mL，已應用于玉米、啤酒兩種樣品中OTA含量的檢測。

3.2 電阻型OTA免疫電化學傳感

電阻型免疫電化學傳感器的建立大多通過電化學阻抗值的變化來表征，如抗體、OTA等分子的阻擋作用使工作電極表面的電子傳遞效率降低，從而導致阻抗值增大。近年的研究也多基于電化學阻抗值增大的原理建立電阻型免疫電化學傳感器。如Jaffrezic-Renault等[59]通過磁場作用，利用磁性納米粒子將OTA單克隆抗體固定在修飾的金電極表面，構建了電阻型OTA免疫電化學傳感，檢出限可達 0.01 ng/mL(圖4A)。

隨著不同材料的應用及電化學檢測方法的建立，研究人員成功構建了電阻減小型OTA免疫電化學傳感器，獲得了較低的檢出限，并取得了良好的實際樣品檢測效果。2016年，Tang等[67]通過構建全新阻抗型免疫電化學傳感器，實現了對紅酒樣品中OTA含量的檢測(圖4B)。實驗將信號分子Mn2+固定在OTA多克隆抗體與氧化石墨烯-聚合物模板上，當OTA存在時，分析物、固定在電極上的OTA-BSA、氧化石墨烯-聚合物模板與OTA抗體之間發生競爭反應，二氧化錳高效催化劑可在無H2O2情況下催化4-氯-1-萘酚(4-CN)在電極上的沉淀，構建的競爭型免疫傳感器的電阻抗值會隨著樣品中OTA濃度的增加而降低。

4 基于分子印跡聚合物的OTA電化學傳感及應用

分子印跡聚合物(MIP)是模板分子(目標化合物)從聚合物中去除后的分子印跡過程的最終產物。其內部具有與模板分子互補的孔道形狀，這賦予了MIPs的高度選擇性和模仿自然抗體和生物受體的能力，同時具有高穩定性、可重復性利用等優點。因此MIPs被廣泛應用于分離純化、催化、傳感等領域[18]。Pacheco等[69]利用OTA分子印跡聚合物構建了OTA電化學傳感，傳感器顯示了高的穩定性和重復性，并成功應用于啤酒和白酒中OTA含量的測定。目前已開發的基于適配體、抗體、分子印跡的新型OTA電化學傳感器在谷物、葡萄、咖啡等樣品中得到廣泛應用，方法具有良好的檢測性能，因此其在食品安全檢測領域中具有重要的應用價值。

5 展 望

近年來，用于OTA檢測的電化學傳感器發展迅速，成為OTA快速檢測的新選擇和新發展趨勢，有望取代復雜、耗時的傳統方法。將電化學檢測技術與納米材料相結合，構建基于抗原-抗體的OTA免疫傳感或基于適配體的OTA適體傳感能獲得更低的檢出限和更寬的檢測范圍。不同金屬納米顆粒、復合納米材料、有機納米材料等已被應用于傳感器的構建。然而，目前的電化學傳感器大部分僅限于理論研究，無法針對復雜的食物基質進行現場快速分析。因此急需開發出可靠、靈敏的可用于復雜樣品快速現場分析的傳感器。因此，對于該領域進一步的研究方向仍需開發新的具有高穩定性和優異功能的納米材料,并將其與電化學技術相結合，構建穩定性更高、檢出限更低的OTA電化學傳感器，以克服傳感器穩定性差等不足。近幾年，本課題組 Liu 等成功篩選出OTA納米抗體——分子量小、性能優異納米抗體，并應用于ELISA[70]或FRET[71]技術。但目前，尚無將OTA納米抗體應用于電化學傳感領域，這也是本課題組未來的研究方向。我們相信基于納米抗體的電化學傳感將有更多的開發空間。