點擊化學在食品安全檢測中的應用研究進展

謝桂芳，蘇本超，謝曉霞，孫志昶，陳 奇，曹宏梅，劉 星

(海南大學 食品科學與工程學院，海南 海口 570228)

1 點擊化學簡介

點擊化學(Click chemistry)由化學家Sharpless于2001年首次提出[1]，又叫“鏈接化學”、“速配接合組合化學”，是一種新型合成方法，其核心是通過一系列可靠高效又具有選擇性及模塊化的化學反應生成含雜原子的化合物，從而實現碳雜原子的連接(C—X—C)，突破傳統化學合成方法的制約。

點擊化學通常具有以下特征：反應模塊化，可與其他反應組合；無有毒有害等副產物；反應效率高，接近定量；反應條件溫和，對水和氧氣不敏感；立體選擇性好；實驗原料易得等。鑒于以上優勢，點擊化學已成為目前的熱門研究領域之一，并在材料科學和合成領域得到了大量的應用[2-5]。

原位點擊化學(In situ click chemistry)[6]是目前點擊化學在合成和其他應用中的常見方法。在合成過程中，參與點擊反應的物質均在溶液中生成，無需進行分離提純，只需向反應液中加入另一種能與之發生點擊反應的試劑即可，簡化了實驗步驟，也在一定程度上提高了反應速率。將原位點擊化學應用于合成類天然產物的研究中，以酶為反應模板，選擇性地連接各模塊組分，可發現各種酶的高親和力抑制劑[7-9]。Bhardwaj等[10]以環氧合酶2為反應容器，將疊氮基標記的吡唑(5、14、27和31)和芳基乙炔進行成對孵育，鑒定出18和21號為環氧合酶2的特異性抑制劑。與臨床使用的抗炎藥相比，化合物18和21表現出優異的體內抗炎活性。Hirose 等[11]利用生理條件下的惰性反應物進行不可逆的靶標導向合成，生成了高親和的抑制劑。通過含疊氮化物Nω-甲基氨基甲酰基-L-精氨酸與乙炔庫之間的特異性偶極環加成反應，篩選出高親和力的幾丁質酶抑制劑，為進一步開發抑菌性藥物提供了理論基礎。此外，原位點擊化學也被應用于體內腫瘤靶向治療[12]、抗HIV病毒因子的篩選[13]、抗體合成[14]等生物醫學領域。

隨著各學科間的交叉融合，檢測技術與點擊化學聯用后，展現出強大的分析檢測性能[15-17]。由于點擊化學反應速率快、立體選擇性好、對溶劑不敏感等特點，基于點擊化學構建的分析方法具有檢測限低、線性范圍廣、可對目標分析物進行準確定量的優勢，在快速檢測方面有著良好的應用前景。

2 常見的點擊化學反應分類

點擊化學反應主要有4種：環加成反應、親和開環反應、非醇醛的羰基反應和碳碳多鍵的加成反應。

2.1 環加成

環加成反應即充分利用模塊化反應融合過程，將兩種不飽和的反應物連接起來，形成各種五元雜環和六元雜環的反應，如Diels Alder反應及1,3-偶極環加成反應。研究最多的是1,3-偶極環加成反應，其中以炔烴和疊氮基的反應最為突出，由Arthur[18]在1983年首次報道，后由Huisgen等[19]正式確立為一類重要的新型反應。在一價銅的催化下，炔基和疊氮基的不飽和鍵發生成環反應(CuAAC反應)，形成1,2,3-三唑，該反應在室溫下即可發生，且對氧氣、pH值、溫度等條件不敏感，為復雜有機物的合成和生物大分子的改性提供了強有力的技術支持。隨著各種交叉學科的出現，當前基于新型點擊反應試劑構建的各類CuAAC檢測方法已有大量報道，主要包括熒光檢測法、比色檢測法、電化學檢測法等(表1)。

表1 基于CuAAC反應的快速檢測方法Table 1 Rapid detection methods based on the CuAAC reaction

CuAAC檢測法通常具有反應基團易修飾、靈敏度好、結果可視化等優勢，然而CuAAC反應需要引入一些具有潛在毒性的金屬催化劑，使其在生物醫藥以及食品領域的應用受限。

2.2 親和開環

親和開環主要是三元雜原子張力環開環并釋放張力能的過程，如環氧衍生物、氮雜環丙烷、環狀硫酸酯、環狀硫酰胺、吖丙啶離子等。在這些三元雜環化合物中，環氧衍生物和吖丙啶離子是最常用的底物，可在醇/水混合溶劑或無溶劑條件下開環形成各種高區域選擇性化合物。此類反應還包括α,β-不飽和羰基化合物的邁克爾加成反應，主要用于天然產物和藥物的合成[34-39]。

2.3 非醇醛的羰基化

非醇醛的羰基化反應又稱“保護基反應”，是一類溫和的羰基化合物縮合反應。此類反應包括：醛或酮與1,3-二醇反應生成1,3-環氧戊環；醛與肼或胲反應生成腙和肟；α-和β-羰基醛、酮和酯生成雜環化合物[40-42]。這些反應均能夠在環境友好的體系中進行，且不產生有害副產物。

2.4 碳碳多鍵加成

碳碳多鍵加成反應通過將原子或基團加成在碳碳鍵兩端，生成具有更高分子量的化合物，包含環氧化反應、二羥基化反應、氮雜環丙烷化反應、雙氫加成以及巰基-烯反應等典型反應。

因不需要金屬催化劑、反應原料范圍廣、具有點擊反應的所有特性，巰基-雙鍵反應近年來已成為點擊反應的研究熱點。根據雙鍵化合物的不同，巰基-雙鍵反應分為兩種反應機理：(1)在光或熱的條件下，巰基與烷烴單烯之間的自由基加成；(2)有機堿(有機胺、有機磷化物等)作為催化劑時，巰基與馬來酰亞胺、(甲基)丙烯酸酯等共軛烯烴的巰基-邁克爾加成。Cleophas等[43]采用巰基-雙鍵點擊化學制備了一種具有優異抗菌性能的PEG基水凝膠涂層，經測試發現，該涂層對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌接種物具有>99%的完全殺死率，顯示了巰-烯點擊化學在抑菌方面的應用功能性。

3 點擊化學在檢測分析中的應用

3.1 食品成分及食品添加劑的檢測

近年來，抗壞血酸常用作護色劑被添加到食品中，而攝入過量的抗壞血酸會導致人體出現一系列不良反應。Qiu等[24]利用CuAAC點擊化學反應構建了一種超靈敏檢測抗壞血酸(AA)的電化學傳感器，將炔丙基功能化的二茂鐵通過與修飾在金電極上的疊氮化末端發生點擊反應修飾到電極上，并采用電化學交流阻抗法檢測金電極在點擊反應前后的電子轉移電阻，以此確定不同濃度抗壞血酸的表面覆蓋分數(θ) 。結果表明，θ值與抗壞血酸濃度對數值在 5.0×10-12～1.0×10-9mol/L范圍內呈線性關系。該傳感器檢測限低至1.3×10-12mol/L，選擇性和穩定性良好，并已成功應用于抗壞血酸的實際檢測。

李燕萍等[25]利用巰基丙酸修飾納米金，并借助酰胺反應分別構建了炔基和疊氮基修飾的兩種不同的AuNPs，通過還原糖將Cu2+還原為Cu+觸發兩種AuNPs的CuAAC反應，實現了對還原糖的定量檢測。該方法的檢出限為0.001 5 μmol/L，可直接用于蜂蜜產品的還原糖檢測。

3.2 農殘獸殘檢測

當前檢測農獸藥殘留的金標準方法主要是高效液相色譜-質譜法、氣相色譜和質譜法，但是這些方法前處理復雜，需借助各種大型儀器，不適用于快速檢測。Dong 等[21]基于點擊化學原理，開發了一種快速高靈敏檢測毒死蜱的免疫分析方法。研究者分別制備了聚谷氨酸(PGA)、疊氮基修飾的聚苯乙烯(PGA-Azide-PS1000)納米粒子和炔基修飾的磁納米顆粒(Alkyne-MNPs)，PGA和Cu2+之間可通過配位化學結合形成刷狀納米結構，調節體系中Cu2+的濃度可觸發CuAAC。毒死蜱會阻止PGA-PS1000-抗原與MNPs-Ab之間形成MNPs-Ab-抗原-PS1000-PGA復合物，因此較少的Cu2+被PGA鍵合，溶液中更多游離Cu2+被抗壞血酸還原為Cu+從而發生CuAAC反應，導致PS1000-MNP30共軛物的形成。MNPs聚集狀態以及濃度變化均會使磁傳感器的橫向馳豫(T2)發生變化，可通過測定體系的T2值來檢測毒死蜱。這種點擊化學和配位化學介導的免疫傳感器可實現對毒死蜱殘留物的超靈敏檢測，檢測限(0.022 ng/mL)較酶聯免疫吸附法(1.28 ng/mL)提高了58倍，所用時間也比金標準法短(圖1A)。

納米金顆粒易與硫醇形成穩定的Au—S鍵，Fu等[22]利用疊氮化物和炔基化合物修飾的AuNPs之間的點擊化學反應，開發了一種快速、高靈敏、肉眼可視化檢測有機磷農藥的方法(圖1B)。多孔有機骨架孔隙率高、比表面積大，在溶劑中有很好的穩定性，Wu等[44]通過光催化的巰-烯點擊化學制備了高度交聯的共價有機骨架(CFOs)，將其固定在化學惰性不銹鋼纖維(SSF)上用作固相微萃取(SPME)的涂層，并與氣相色譜法聯用對黃瓜中的農藥殘留量進行了檢測。

殺螨劑氟咪唑嗪的炔基能夠與3-疊氮-7-羥基香豆素反應，在Cu+催化下發生疊氮炔環加成生成強熒光的1,2,3-三唑，Lu等[23]據此開發了一種能夠靈敏特異性檢測氟咪唑嗪的熒光傳感方法，線性范圍為0.25～6.0 μg/L，檢測限為0.18 μg/L(圖1C)。

抗生素殘留是繼農藥殘留后又一嚴重的獸藥殘留問題，目前對食品中抗生素的檢測仍以大型精密儀器分析法為主，其樣品前處理復雜耗時，而點擊化學與其他技術聯用可大大縮短檢測時長。Belal等[45]基于DNA適配體片段的互補作用以及Cu+催化的點擊反應，開發出能夠高靈敏、快速(2 h內)檢測卡那霉素的熒光分析法。主要機理為：一條DNA單鏈采用生物素修飾，另一條DNA單鏈采用CuS納米顆粒修飾，僅在卡那霉素存在的情況下這兩條DNA單鏈互補形成雙鏈，產生的卡那霉素-雙鏈DNA-CuS經磁分離后，CuS被抗壞血酸還原為Cu+而觸發3-疊氮基-7-羥基香豆素與炔丙醇之間的CuAAC反應，生成具有熒光的1,4-二取代-1,2,3-三唑。該反應體系熒光強度與卡那霉素濃度(0.04～20 nmol/L)具有良好的線性關系，方法檢測限低至26 pmol/L。

Xianyu等[46]通過不同尺寸的反式環辛烯(TCO)功能化的聚苯乙烯珠(TCO-PS)和1,2,4,5-四嗪(Tz)功能化的30 nm磁珠(Tz-MNP30)之間的“TCO-Tz點擊反應”制備了具有核-衛星結構的磁探針，結合抗體-抗原相互作用和磁分離，利用這些多功能磁探針產生的磁弛豫轉換(Magnetic relaxation switching,MRS)信號可實現對多種抗生素的高靈敏檢測。用該方法分別進行土霉素、磺酰胺和氯霉素的含量檢測，所得結果準確可靠，并有望進一步應用于生物醫學和食品安全檢測。

圖1 基于點擊化學引起T2信號值變化檢測毒死蜱(A)[21]，點擊化學結合納米金顆粒可視化檢測有機磷農藥(B)[22]， 利用點擊化學生成強熒光的1,2,3-三唑(C)[23]Fig.1 Detection of chlorpyrifos based on changes in T2 signal value caused by click chemistry(A)[21], combination of click chemistry and gold nanoparticles to visually detect organophosphorus pesticides(B)[22]， preparation of 1,2,3-triazole with highly fluorescence using click chemistry(C)[23] 1.3-azide-7-hydroxycoumarin(3-疊氮化物-7-羥基香豆素);2.flumioxazin(氟米嗪);3.3-azide-7-hydroxycoumarin+Cu2++SA (3-疊氮化物-7-羥基香豆素+二價銅離子+鏈霉親和素);4.flumioxazin+Cu2++SA(氟米嗪+二價銅離子+鏈霉親和素); 5.3-azide-7-hydroxycoumarin+Cu2++SA+flumioxazin(3-疊氮化物-7-羥基香豆素+二價銅離子+鏈霉親和素+氟米嗪)

3.3 真菌毒素檢測

真菌毒素如黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等極易污染糧食、谷物、咖啡、啤酒和茶葉等，對動物和人具有致畸、致癌、致突變和免疫抑制等毒性作用[47-49]。當前，對AFB1、OTA、ZEN等的檢測以傳統的儀器分析法為主，如高效液相色譜法[50]、薄層色譜[51]等。這類方法靈敏度高且準確性好，但存在樣品前處理復雜、需要專業操作人員和設備昂貴等不足，限制了其在基層的推廣使用。因此，開發低成本快速檢測抗生素的方法作為大型精密儀器分析法的有力補充顯得尤為重要。

Qiu等[26]分別制備了疊氮基-OTA適配體修飾的磁珠(N3-OTA適配體-MBs，DNA1)和蔗糖轉化酶功能化的炔基-DNA偶聯物(炔基DNA-蔗糖轉化酶，DNA2)，以個人血糖儀(Personal glucose meter,PGM)作為信號讀出器建立了微量OTA(72 pg/mL)的檢測方法。DNA1與DNA2間發生CuAAC反應形成雙鏈的dsDNA，存在OTA時，OTA與其適配體結合，使得dsDNA雙鏈解開，經磁珠分離后上清液中的DNA2量增多，PGM信號變強，從而實現對OTA的高靈敏檢測。

Xu等[52]通過光引發多面體低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS) 單體聚合形成含活性烯基的剛性骨架，并在70 ℃下引發巰基化的玉米烯酮適體(SH-ZEN適體)和烯基間的“巰-烯點擊化學”,得到被極性適體致密包被的親和整體柱，最終與HPLC聯用對大米中的ZEN進行檢測，實驗結果準確可靠。Chen等[53]基于自由基聚合和“硫醇-烯”點擊反應，采用“一鍋法”直接制備了一種新型的基于OTA適體的含POSS雜合親和性整體柱，并用于啤酒樣品中OTA的檢測，該法特異性好且能夠檢測痕量OTA。

圖2 點擊化學引起的GO-C2和Rho-N3間的FRET效 應(A)[32]，點擊化學形成的Mg2+依賴性DNA酶結合 血紅素比色檢測Cu2+(B)[30]Fig.2 FRET effect between GO-C2 and Rho-N3 caused by click chemistry(A)[32]，colorimetric detection of Cu2+ using Mg2+ dependent DNAzyme formed by click chemistry and heme(B)[30]

3.4 重金屬檢測

微量金屬如銅、鐵等是人體生長發育的必需元素，但攝入過量或者不足以及不平衡均會引起人體生理異常或發生疾病[54-55]。此外，環境中的重金屬如汞、鎘等也會影響人體健康[56-57]。因此，開發金屬殘留的高靈敏檢測方法極為重要。

熒光共振能量轉移(FRET)技術具有靈敏度高、反應速度快等優勢，常作為反應信號放大手段用于分析檢測。氧化石墨烯(GO)是一種理想的能量受體，可與許多物質發生FRET猝滅其熒光。Zheng等[32]利用炔基修飾的氧化石墨烯(GO-C2)和疊氮基修飾的羅丹明100(Rho-N3)間發生CuAAC反應導致Rho-N3的熒光被顯著猝滅的機理，實現了Cu2+的高靈敏檢測。該方法可以高效快速(1 min)地檢測尿液中的Cu2+，為臨床診斷提供了一定的理論基礎(圖2A)。

在AuNPs的局部表面等離子體激元共振(LSPR)和CuAAC反應高特異性的基礎上，Zhou等[33]通過配體交換反應制備了疊氮基和炔基修飾的AuNPs，利用CuAAC反應使兩種AuNPs交聯并引發聚集使體系溶液從紅色變為藍色，進而通過肉眼對Cu2+進行了定性檢測。Carol等[27]通過二炔交聯劑誘導疊氮基修飾的AuNPs聚集實現了Cu2+的靈敏檢測，檢測限低至1.8 μmol/L。AuNPs易在高濃度鹽溶液中發生聚集，導致顏色由紅變藍，但是谷胱甘肽存在時則會抑制這一現象。

除CuAAC反應外，光或熱引發的“巰-烯”點擊化學也常應用于材料修飾中。Zuo等[58]通過光引發的“巰-烯點擊化學”合成咪唑官能化聚硅氧烷(PMMS-IM)，該材料在365 nm處表現出強烈熒光。過渡金屬離子Fe3+等能夠與富電子基團發生配位結合而引起熒光猝滅，故作者將PMMS-IM用作Fe3+的熒光檢測探針，并用于檢測Hela細胞中Fe3+的原位循環。

脫氧核酶(DNAzyme)是在體外篩選、擴增獲得的一種具有催化功能的DNA片段[59]，可形成G-四鏈體并結合血紅素，適用于小分子、金屬離子、DNA等的檢測。Li等[30]結合Cu+催化的點擊化學和Mg2+依賴性DNAzyme循環擴增的策略，開發了一種可靈敏檢測人血清中Cu2+的比色傳感法，該方法的線性范圍為5～500 nmol/L，檢測限低至2 nmol/L(圖2B)。

CuAAC反應生成的三唑環在檢測體系中具有極大的作用：(1)作為與目標分析物的結合位點；(2)作為離子載體與熒光團之間的連接基團。Hou等[29]利用CuAAC反應合成了含有兩個三唑環的新型二甲苯苯基環烷烴1，其在292 nm激發波長處具有強熒光。在甲醇溶液中，該環烷烴1的三唑環能特異性地結合Ag+，同時，由于螯合增強熒光猝滅(CHEQ)效應，使得環烷烴1的熒光被顯著猝滅，從而可實現對Ag+的檢測。Zhang等[33]利用Cu+觸發UiO-66-N3與苯乙炔的點擊反應，合成了一種新型金屬有機骨架(MOF)熒光探針UiO-66-PSM，該探針的三唑環可以與Hg2+配位結合猝滅UiO-66-PSM的熒光，較其他金屬離子表現出更明顯的熒光響應，且在水溶液中有很好的穩定性，可用于環境水體中Hg2+的檢測。

Fomo等[28]基于疊氮基苯胺鹽酸鹽與炔烴封端的金屬鈦氰(MPc)的CuAAC反應，制備了一種新型低對稱炔末端鈷——酞菁鈷(CoPc)。將該CoPc經差動脈沖溶出伏安法(DPSV)修飾于玻碳電極上，可同時檢測Hg2+、Cu+、Pb2+、Cd2+和As3+等金屬離子。

3.5 食源性致病菌

食源性疾病是全球最突出的公共衛生問題之一，隨著食品供應鏈的快速發展，食源性疾病在全球各地的蔓延不僅危害人體健康，還會造成嚴重的經濟問題。目前食源性致病菌的檢測手段主要是傳統的選擇性平板培養和凝集實驗等，以上方法存在操作繁瑣、檢測周期長等缺點，不能滿足食源性致病菌快速檢測的迫切需求。

Huang等[60]開發了一種無酶生物傳感器用于快速(1 h內)檢測沙門氏菌。研究者首先制備了姜黃素-牛血清白蛋白納米顆粒(CUR-BSA)，通過反式環辛烯(Tz)-1,2,4,5-四嗪(TCO)間的無銅點擊化學反應形成Tz-TCO-CUR復合物后將其進行抗體功能化，并結合磁分離技術對沙門氏菌進行定性和定量檢測，方法檢測限低至50 CFU/mL。

此外，Guo等[16]綜合旋轉磁分離法、金納米管(GNR)指示法以及Tz-TCO點擊化學信號放大法，建立了一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的比色免疫傳感器。該免疫傳感器檢測時間為3 h，線性范圍為101～105CFU/mL，檢出限為35 CFU/mL。

大腸桿菌(E.coli)能夠特異性地捕獲環境中的Cu2+將其還原為Cu+，Mou等[20]基于此并利用疊氮-AuNPs和炔烴-AuNPs的CuAAC反應，實現了對大腸桿菌的快速靈敏檢測。當存在E.coli時，外源性Cu2+被E.coli還原為Cu+而觸發CuAAC反應，導致金納米顆粒聚集并使體系由紅色變為藍色，僅用肉眼即可快速輕松地實現病原菌的檢測。

4 結論與展望

作為一類新型的合成反應，點擊化學由于其生物相容性和環境友好性等優勢被大量研究，并在諸多領域得到廣泛應用。值得注意的是，將免疫分析法和點擊化學反應有效結合，能夠實現分析物更加快速靈敏的檢測，例如，利用基因工程技術制備抗體與反應底物催化酶的融合蛋白用于替代傳統免疫分析法中的一抗和酶標二抗，能夠減少孵育反應次數和洗滌次數，極大地縮短檢測時間，同時避免了過多孵育和洗滌次數對靈敏度的影響。當前，點擊化學在食品安全檢測領域的應用研究尚處于初期階段，盡管已取得了較好的研究進展，但現階段點擊化學自身存在的局限性仍需引起研究人員的重視。如：(1)點擊化學的發生需要特定的反應基團參與，而在納米材料上修飾反應基團則操作繁瑣費時；(2)點擊化學反應類型較少，已報道的點擊化學反應大部分都是疊氮化物與端基炔的1,3-偶極環加成反應和巰基-烯加成反應；(3)需要加入過量的銅鹽使點擊化學反應完全，提高了反應成本；(4)疊氮化合物危險性高、毒性強，嚴重威脅研究人員的生命健康。因此，針對上述問題，亟需開發出更為經濟、綠色、安全的點擊化學反應類型，使點擊化學在食品安全檢測領域得到更為深入的研究，同時有助于拓寬點擊化學在其他研究方向的應用。