基于共振能量轉移的生物傳感器在食品安全檢測中的應用研究進展

包昆鷺，許 琪，曹宏梅，劉 星，陳 奇*

(1.海南大學 食品科學與工程學院，海南 ?？?570228；2.海南省食品營養與功能食品重點實驗室， 海南 ?？?570228)

共振能量轉移(Resonance energy transfer，RET)是一種發生在供體-受體之間的非輻射能量轉移過程，該過程的發生需要滿足以下特定條件：第一，供體-受體間的距離必須足夠小，研究表明，10 nm以內才能有效地發生能量轉移，且距離是影響RET效率的最主要因素(效率和供體-受體間距離的六次方成反比)；第二，供體的發射光譜和受體的吸收光譜必須有效重疊，其重疊程度對能量轉移效率有較大影響；第三，供體-受體偶極間要有一定取向，其相對位置也會影響能量轉移效率[1]。共振能量轉移類型按發光方式可以分為以下3種：熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)、生物發光共振能量轉移(Bioluminescence resonance energy transfer，BRET)和化學發光共振能量轉移(Chemiluminescence resonance energy transfer，CRET)。上述3種類型的共振能量轉移技術，近年來得到了廣泛關注，并被應用于醫學診斷[2]、生命科學研究[3]、環境監控[4]以及食品安全[5]等領域。

近年來，隨著食品行業的逐步發展，食品安全問題備受關注。食品中常見的危害因子主要包括非法添加劑、激素、致病菌、農獸藥殘留、生物毒素、重金屬及有毒化合物等。現有檢測技術如色譜技術、光譜技術、免疫分析等已得到廣泛應用。其中，基于儀器的色譜技術和光譜技術因準確度高通常作為確證方法，免疫分析等技術操作簡單、成本低廉，通常作為篩查方法。為改善傳統分析方法存在的靈敏度低和耗時久等不足，越來越多的新技術被引入食品安全分析領域。其中基于RET的新型生物傳感分析技術，因具有靈敏度高、操作簡便及速度快等優點而備受關注。本文依據能量供體的不同，對3種類型的RET在食品安全領域的研究進行綜述，同時展望了其應用前景和發展趨勢。

1 FRET在食品安全檢測中的應用

FRET又稱福斯特共振能量轉移，由F?rster在1948年提出，指受激發的供體與受體之間通過偶極-偶極相互作用以非輻射形式進行能量傳遞的過程[6]。FRET是一種均相光學檢測技術，具有操作簡便、靈敏度高、反應速度快等優點，近年來在生物毒素、非法添加劑、激素、致病菌、農獸藥殘留、生物毒素、重金屬及有毒化合物等食品危害因子快速檢測中得到了廣泛應用。

圖1 基于FRET檢測雞蛋中氟蟲腈殘留的工作原理圖[7]Fig.1 The principle diagram of detecting fipronil residue in eggs based on FRET[7]

1.1 有機熒光染料在FRET中的應用

在早期FRET中，常使用有機熒光染料作為供體-受體對，有機熒光染料具有成本低、無毒性等優點，典型的有Cy系列菁染料如Cy3和Cy5，以及羧基熒光素(FAM)等。Kim等[7]利用FRET技術檢測農藥氟蟲腈殘留，其工作原理如圖1所示。在氟蟲腈適配子的3’端標記上FAM，并在與適配子互補的cDNA的5’端標記猝滅基團羧基四甲基羅丹明(TAMRA)。樣品中無氟蟲腈時，適配子與cDNA互補形成雙鏈，使得FAM與TAMRA距離足夠近，導致發生FRET，從而使FAM的熒光被TAMRA猝滅。而當樣品中存在氟蟲腈時，適配子識別并結合氟蟲腈，雙鏈DNA解離,TAMRA遠離FAM，被猝滅的FAM熒光恢復，且熒光強度隨氟蟲腈濃度的增加而增強，從而可實現對氟蟲腈的定量檢測。該方法操作簡單，無需洗滌，可在30 min內完成檢測，對雞蛋樣品的線性范圍為25～300 ng/mL，最低檢測限為53.8 ng/mL。FAM是一種被廣泛使用的熒光染料，其猝滅基團也有很多選擇，如叔丁基對苯二酚1(BHQ1)[8]、金屬-有機骨架材料(Metal-organic frameworks，MOFs)[9]等。

早期的FRET中供體及受體多使用有機熒光染料，然而，傳統有機熒光染料存在光化學穩定性差、光漂白及光降解現象嚴重、熒光壽命短、吸收光譜窄且易發生光譜重疊等缺陷[10]，因此正逐步被新型的熒光材料替代。

1.2 量子點在FRET中的應用

半導體量子點(Quantum dot，QD)是一種由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的納米顆粒，與傳統有機熒光染料相比，QD的激發光譜寬，可被紫外到遠紅外區的任意波長光激發，作為FRET供體時具有很大的可選擇性，可避免受體被直接激發。而當QD作為FRET受體時，窄且對稱的發射光譜可減少與供體發射光譜的重疊，避免相互間的干擾。此外，QD還具有發光強度高、熒光量子產率較高、不易光漂白等獨特的光學特性[11]，比傳統熒光染料更適合用于構建FRET體系。

圖2 用于檢測BoNT的QD-FRET生物 傳感器工作原理圖[12]Fig.2 The principle diagram of QD-FRET biosensor for detecting BoNT[12]

圖3 用于檢測OTA和OTB的基于納米抗體的 QD-FRET免疫檢測工作原理圖[14]Fig.3 The diagram of nanobody-based QD-FRET immunoassay for detecting OTA and OTB[14]

Wang等[12]開發了一種基于QD的FRET生物傳感器用于檢測肉毒桿菌神經毒素(BoNT)，其工作原理如圖2所示。首先將含有酶切位點的多肽與熒光猝滅劑結合，并通過多聚組氨酸結合到QD表面實現FRET,QD發光減弱；BoNT存在時，多肽被毒素切割，猝滅劑與QD分離，FRET狀態關閉,QD熒光增強。該生物傳感器可在3 h內實現對兩種不同類型BoNT(LcA和LcB)的檢測，檢測限分別為0.2 ng/mL及2 ng/mL。與Sapsford等[13]的研究相比，該研究通過使用熒光猝滅劑將靈敏度提高約兩個數量級。

本實驗室開發了基于納米抗體同時檢測赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)和赭曲霉毒素B(Ochratoxin B，OTB)的FRET免疫分析方法[14]，其工作原理如圖3所示。該研究利用抗體中色氨酸殘基有固有熒光這一特點，將其作為供體，并以與抗原偶聯的量子點作為受體，在抗體識別抗原的過程中即可完成FRET。與完整抗體相比，納米抗體尺寸較小[15]，有助于縮短抗體中色氨酸殘基與抗原之間的距離，提高FRET效率，該方法對OTA和OTB的檢測限分別達0.06 ng/mL和0.12 ng/mL。

在FRET體系中，由于QD激發光譜寬，為避免對受體的直接激發，QD通常被用作供體，但同時利用兩種QDs作為供體-受體對的研究報道并不多見。Xu等[16]利用兩種不同尺寸的QDs成功構建FRET體系，并探討了供體-受體偶聯物標記比率對能量轉移效率的影響，最終用于大米中黃曲霉毒素B1(AFB1)的免疫檢測，其定量范圍為0.06～5.0 ng/mL，最低檢測限為0.04 ng/mL。檢測結果與商業化試劑盒具有良好的相關性，顯示出廣闊的應用前景。

QDs優越的性能使其作為熒光標記物得到了快速發展，但依然存在一些需要解決的問題，如具有生物毒性、價格昂貴、與傳統有機熒光染料一樣需要高能量的外源激發光、組織穿透能力較低、易受生物組織自發熒光的干擾等。上述缺陷在一定程度上限制了基于QDs的FRET技術的應用范圍。

1.3 貴金屬納米材料在FRET中的應用

隨著納米科學的不斷發展，多種新型、性能更加優越的貴金屬納米材料被深入地運用到檢測領域中。貴金屬納米顆粒的尺寸一般在100 nm以內，顆粒表面的等離子使金屬表面產生電荷聚集，導致表面電荷密度增大，局域場增強，從而引發增強效應。同時，貴金屬納米顆粒還有特殊的光學性質如光致發光效應和表面等離子共振等，已成為當前的研究熱點[17-18]。銀納米顆粒(AgNPs)具有強消光性，其摩爾消光系數大于1010cm-1·M-1，是納米金顆粒(AuNPs)的100倍，同時還具有吸收光譜寬、穩定性和生物相容性好等優良性能，是一種理想的熒光猝滅劑，可在FRET體系中作為受體有效地猝滅被激發供體所發射的熒光[19]。Carneiro等[20]以碳量子點(CQDs)為供體，AgNPs為受體構建了用于檢測食品中農藥殘留的FRET生物傳感器，通過檢測大米、胡蘿卜、桔子和胡椒中不同的農藥殘留(丙二醇、對硫磷、樂果、毒死蜱和嘧咪卡卜)證實了該生物傳感器的實用性。熒光金屬納米簇由幾個到幾百個原子組成，尺寸通常在2 nm之內，特性則介于單個原子與較大的納米粒子之間[21-22]。Khan等[23]將適配體與銀納米簇結合作為能量供體，其熒光會被Mo2C受體猝滅，而在加入靶標競爭時熒光恢復。這種動態定量檢測方法對T-2毒素的檢測范圍為0.005～500 ng/mL，檢測限為0.93 pg/mL，在方法學評價中展現出良好的實用性。

1.4 上轉換發光材料在FRET中的應用

除貴金屬納米材料外，上轉換發光材料(UCNPs)也是當前研究的熱點，其具有較低的聲子能量和較高的化學穩定性，是目前公認的發光效率最高的納米材料之一[24]。上轉換發光是反-斯托克斯發光，材料受到低能量的光激發后，發射出高能量的光。Wu等[25]使用紅色和綠色的UCNPs為供體，AuNPs為受體構建了一種新型的雙FRET檢測系統，實現了海產品等樣品中Hg2+和Pb2+的同步檢測。該生物傳感器對Hg2+和Pb2+的檢測范圍分別為0.5～500 nmol/L和0.1～100 nmol/L，檢測限分別為150 pmol/L和50 pmol/L。上轉換發光材料因形貌可控、尺寸可調、粒徑均一、有良好的化學穩定性和光穩定性而得到應用，但增大發光強度及轉換效率仍將會是以后的研究重點。

2 BRET在食品安全檢測中的應用

BRET是基于海洋生物體內發現的一種自然現象，即以熒光生物體內的熒光素酶作為供體，為實現供體-受體的能量非輻射轉移過程而開發的一種新型RET技術[26]。與FRET相比，BRET能量供體為可催化底物發射熒光的熒光素酶，因此無需外界光源激發，可避免外源光激發所引起的諸多副作用，如受體被外源光直接激發產生“假陽性”信號以及復雜樣品基質的背景熒光及散射光干擾導致信噪比降低和靈敏度下降等問題[27]。因此，在一些需要低背景和高靈敏度的研究中，BRET顯示出巨大的優勢，并日益受到研究者的關注。

目前BRET在分子成像[28]、醫學標志物檢測[29]等方面已有較廣泛的應用，但在食品安全檢測中的應用還較為少見。Yu等[30]以海腎熒光素酶(Renilla luciferase，Rluc)為供體，量子點為受體，建立的QD-BRET體系實現了牛奶樣品中諾氟沙星(NOR)的定量檢測，方法的IC50為1 ng/mL，線性范圍為0.023～25.60 ng/mL，覆蓋4個數量級，顯示出優越的性能。

3 CRET在食品安全檢測中的應用

CRET是化學發光反應產生的能量以非輻射的方式轉移給受體，不需要外源激發光[31]。目前常見的有魯米諾化學發光體系、吖啶酯化合物化學發光體系及二氧雜環丁烷類化學發光體系等，其中魯米諾化學發光體系應用最為廣泛。Jo等[32]利用魯米諾發光體系構建了用于檢測赭曲霉毒素A(OTA)的CRET生物傳感器，檢測范圍為0.1～100 ng/mL，最低檢測限為0.22 ng/mL，顯示出良好的應用潛力。Ma等[33]建立了基于免疫競爭法的QDs-CRET生物傳感器用于檢測獸藥磺胺二甲嘧啶(SMZ)，檢測限為9 pg/mL，靈敏度比酶聯免疫吸附法(ELISA)和熒光偏振免疫分析法(FPIA)高出2～4個數量級，顯示出優越的分析性能。

電化學發光(Electrochemiluminescence，ECL)具有高靈敏、反應體系可控等優點[34-35]，電化學發光生物傳感器則融合了ECL和生物傳感器的優點，成為食品分析領域中強有力的分析手段[36-37]。Feng等[38]設計了一種基于雙齒輪轉換、電化學發光共振能量轉移(Electrochemiluminescence resonance energy transfer,ERET)和表面等離子體共振(Surface plasmon resonance,SPR)的多重選擇性測定卡那霉素和新霉素的雙齒輪電化學發光法。通過雙齒輪上供體-受體間的ERET過程，改變ECL強度，達到卡那霉素和新霉素檢測的目的。該傳感器對于卡那霉素(10-10～10-6mol/L)和新霉素(10-9～10-5mol/L)的檢測范圍較寬，檢測限分別達1.7×10-11mol/L和3.5×10-10mol/L。

隨著納米材料研究的進步，一些新型的納米材料也被用于構建CRET體系。Sun等[39]構建了基于MOFs的CRET生物傳感器用于飲用水中氟離子的檢測，檢測范圍為0.5～80.0 μmol/L，最低檢測限為0.05 μmol/L。雖然目前CRET在食品安全檢測中的應用并不多見，但其靈敏多樣的檢測體系正在吸引大批學者的目光。

近年來RET在食品危害因子快速檢測中的相關應用見表1。

表1 3種RET在食品安全檢測中的應用Table 1 The application of three kinds of RETs in food safety detection

4 結論及展望

基于RET的生物傳感器作為一種均相光學檢測技術，具有操作簡便、靈敏度高、快速等優點，其中FRET更是得到了廣泛應用。為了減少FRET外源激發光帶來的干擾，也有學者合成了具有雙光子激發特性的熒光探針，并以其為能量供體構建雙光子激發-FRET[55]。與FRET相比，BRET及CRET無需外界光源激發，可避免外源光激發所引起的諸多副作用，極大地減少背景干擾以及“假陽性”問題，在檢測領域顯示出巨大的優勢，并日益受到研究者的關注。此外一些新型生物識別元件，包括核酸適配體及納米抗體等，由于具有尺寸小，能顯著提高RET能量轉移效率的特點，在構建RET體系時顯示出巨大的優勢。均相檢測方法具有快速、操作簡便且易于自動化等優點，已經成為檢測分析領域研究的熱點，其中基于RET的生物傳感器更是備受關注。但將其用于現場快檢時，檢測儀器的小型化、集成化及多功能化以及檢測結果的可視化、分析簡化也將是今后工作的研究重點。