基質輔助激光解吸電離-傅里葉變換離子回旋共振質譜法快速測定蔬菜中百草枯與敵草快

陳 超，潘佳釧，劉舒芹，郭鵬然*

(1.廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心) 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070;2.廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心) 廣東省原位電離質譜分析工程 技術研究中心，廣東 廣州 510070)

百草枯(1,1′-二甲基-4,4′-聯吡啶二氯鹽，Paraquat)和敵草快(1,1′-亞乙基-2,2′-聯吡啶二溴鹽，Diquat)均為聯吡啶類陽離子季銨鹽，具有高水溶性和低揮發性，屬于非選擇性觸殺滅生型除草劑，因價格低廉，在全球范圍內被廣泛使用。由于百草枯和敵草快對人和動物具有很強的毒性[1-2]，因此它們在農業中的廣泛使用引起了人們對其在食品中殘留問題的關注。研究發現長期接觸百草枯會增加帕金森病(PD)的發病風險，因此其也被認為是帕金森病的環境危險因素之一[3]。我國食品安全國家標準(GB 2763-2016)對蔬菜和水果中百草枯和敵草快殘留均有明確限量要求，其中百草枯的最大殘留限量為0.01～0.2 mg/kg，敵草快為0.01～0.1 mg/kg[4]。

目前，已被報道用于水果蔬菜中百草枯和敵草快含量測定的方法主要有液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[5-7]、酶聯免疫分析法(ELISA)[8]、表面增強拉曼光譜法(SERS)[9-10]、液相色譜法(HPLC)[11]和電化學法(EIS)[12-13]等。但這些方法大部分需要對蔬菜提取液進行凈化處理，無法實現快速、高通量篩查。而基質輔助激光解吸電離(MALDI)分析技術因樣品分散在固體基質中，能更有效地吸收激光能量，利用紫外或紅外激光的脈沖輻射將待測物快速解析/電離成帶正電荷或負電荷的離子[14]，可實現樣品的快速、高通量分析。

傅里葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)則具有超高分辨率、靈敏度高、精確度高等優點，將MALDI與FTICR-MS聯用，具有分析速度快、耐鹽度好等優點[15-16]。鑒于此，本研究建立了一種利用MALDI-FTICR-MS測定蔬菜中百草枯和敵草快的方法，樣品用含1%甲酸的乙腈溶液提取后，與MALDI基質混合即可直接進樣分析，對于基質復雜的樣品無需凈化，提取后即可直接快速測定樣品中微量的百草枯和敵草快，有效填補了蔬菜中百草枯和敵草快快速高通量篩查檢測研究的空白。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

配有基質輔助激光解吸電離源的Solarix XR 7.0 T傅里葉變換離子回旋共振質譜儀(MALDI-FTICR-MS，德國Bruker公司)，配Smartbeam Ⅱ型固態激光器，最大能量300 μJ，頻率在 0～1 kHz 內可調，波長為355 nm；數據處理軟件(DataAnalysis 5.0，德國 Bruker 公司)；BSA224S 型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；H1850型離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；HR2534手持攪拌料理機(飛利浦中國投資有限公司)；JP-060S 型超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；VORTEX 1型旋渦混合器(德國IKA公司)。

百草枯(純度為82.4%)、百草枯-D8(純度為95.9%)、敵草快(純度為96.4%)、敵草快-D4(純度為93.4%)標準品均購自德國Dr Ehrenstorfer公司；2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB，德國Bruker公司)；α-氰基-4-羥基肉桂酸和芥子酸(CHCA和SA，美國Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)；甲酸(LC-MS級，美國Thermo Fisher Scientific公司)；三氟乙酸鈉校準溶液(NaTFA，美國Sigma-Aldrich公司)；實驗用水為Milli-Q超純水系統制備的超純水；蔬菜樣品均為當地市場購買。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取適量(精確至0.000 1 g)百草枯、敵草快、百草枯-D8和敵草快-D4標準品，用純水溶解并定容，分別配成質量濃度為100 mg/L的儲備液，置于塑料瓶中于-20 ℃保存。用溶劑或不同基質溶液分別配制含百草枯和敵草快質量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/L的系列標準工作溶液；用乙腈-0.2%甲酸水溶液(體積比1∶1)將百草枯-D8儲備液和敵草快-D4儲備液稀釋成質量濃度為100 μg/L的混合內標工作溶液。

1.3 樣品制備

1.3.1 提 取取250 g蔬菜樣品，用手持攪拌料理機直接勻漿，精密稱取1 g(精確至0.001 g)于10 mL塑料離心管中，加入4 mL含1%甲酸的乙腈溶液混勻后，超聲10 min，再渦旋1 min，在室溫下以5 000 r/min離心5 min，取上清液定容至5 mL，混勻后備用。

1.3.2 點 樣取10 μL上清液與10 μL混合內標工作溶液(100 μg/L)及20 μL CHCA(2 g/L，用30%乙腈水溶液配制)溶液混合均勻，準確量取3 μL該混合液點于MALDI靶板上，待液滴自然晾干(需等待5～10 min)形成均勻結晶層后進樣分析。

1.4 質譜條件

在正離子模式下采用MALDI源，質量采集范圍為m/z50～300，采樣大小為2 M，累加次數為8，Skimmer(錐孔電壓)為40 V；激光能量為40%，頻率為100 Hz，激光點數為100 Shots，光斑為Medium，激光路徑為Random。數據采集前，在ESI離子源模式下采用0.01 g/L三氟乙酸鈉溶液(用50%乙腈水溶液配制)進行儀器校準；數據采集過程中鎖定百草枯-D8內標離子m/z194.165 36進行實時校正，以保證數據采集中質量軸的準確性。定性分析離子對：百草枯m/z186.115 15 → 171.091 67，敵草快m/z184.099 50 → 183.091 67；百草枯和敵草快的定量離子分別為m/z186.115 15和m/z184.099 50，內標法定量(百草枯-D8和敵草快-D4參與計算的離子峰分別為m/z194.165 36和188.124 61)。

2 結果與討論

2.1 MALDI基質類型與濃度的選擇

前期實驗[16]發現，當MALDI基質濃度選用10 g/L時，2,5-DHB和CHCA比SA更適用于百草枯測定時的輔助電離基質，而2,5-DHB可使方法檢出限更低，這是因為在此濃度下CHCA的結晶層很厚，影響了待測物的激發。由于2,5-DHB和CHCA對聯吡啶類化合物均有較強輔助電離作用[17]，本研究對比了低濃度2,5-DHB 和CHCA對百草枯和敵草快響應的影響。結果顯示，當2,5-DHB的質量濃度低于10 g/L點樣時，形成的結晶層太薄且不均勻，易產生“甜點效應”(由于基質-分子的共結晶不均勻，以及樣品溶液晾干時的咖啡環效應，分子在基底上分布極其不均勻，產生分子聚集，使得檢測時點與點之間信號差異特別大，導致信號很強的區域被稱之為“甜點”；這種分子分布不均勻最終導致選點時存在偶然性以及主觀性，不能對實驗結果進行準確的分析)[18]；而CHCA的質量濃度為1 g/L時仍能形成均勻的結晶層，且百草枯和敵草快的響應比采用10 g/L時的2,5-DHB高5倍，因此實驗選擇CHCA為輔助電離基質。

本研究按“1.3”進行樣品提取及點樣，考察不同濃度CHCA分別與純標準溶液(用空白溶劑配制，100 μg/L)和樣品基質標準溶液(小白菜提取液，100 μg/L)等比例混合點樣后的分析結果(圖1)。由圖可見，純標準溶液與1 g/L CHCA混合后點樣得到的百草枯和敵草快的響應最高，而樣品基質配制的標準溶液在2 g/L CHCA中信號強度最高，與純標液和樣品基質配制的標液響應相近，且重復6次點樣測試結果的相對標準偏差(RSD)為2.6%和4.8%，檢出限滿足檢測要求[19]。故本方法最終選擇質量濃度為2 g/L的CHCA為MALDI基質輔助用于樣品中百草枯和敵草快的電離。

2.2 質譜條件的優化

本研究在前期實驗[16]的質譜條件下進行了優化，發現用2 g/L CHCA為MALDI基質時，儀器激光能量和Skimmer電壓分別提高至40%和40 V，且儀器未出現質量軸偏移的情況。在此質譜條件下，百草枯和敵草快產生3種類型的離子峰：百草枯m/z186.115 15、185.107 32和171.091 67，敵草快m/z184.099 50、183.091 67和157.076 02，與文獻報道一致[20]。每種待測物選取一對響應高的離子峰作為定性分析的離子對，并以其中響應最高的離子峰作為定量離子，優化后的質譜條件見“1.4”。

2.3 提取條件的選擇

百草枯和敵草快均為堿性陽離子型化合物，易溶于酸性水溶液而不溶于有機試劑[21]。在提取條件優化過程中，發現由于新鮮蔬菜的水分含量一般大于50%，若提取溶劑中水的比例過高或提取的物質濃度過高時，會導致百草枯和敵草快的質譜峰響應低且加標回收率均低于50%。同時，觀察到MALDI靶板上的點樣點形成的結晶層很厚且不均勻，這可能是因為高比例水會從樣品中提取出大量糖類物質，從而形成緊密的類似膠狀物的結晶層，使得待測物分散的不夠均勻，且激光無法穿透過厚的樣品層，影響待測物的離子化效率。參考文獻報道[6,21]，分別選取乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)、含0.2%甲酸的乙腈溶液、含1%甲酸的乙腈溶液和含5%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑，按“1.3”方法對空白小白菜進行加標回收實驗(加標量為100 μg/L)。結果顯示，采用含1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑時的加標回收率最高，故最終選擇含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性與基質效應的評價選取7種空白蔬菜(冬瓜、黃瓜、小白菜、上海青、韭菜、芹菜、生菜)在優化條件下提取和點樣分析，采用精確分子量對應的質譜峰強度定量，發現百草枯、敵草快及其內標在7種空白蔬菜樣品中定量定性離子峰位置均無干擾離子峰，專屬性符合要求。

實驗采用標準曲線斜率的比值評價基質效應(Matrix effects,ME)，其計算公式為ME=Ka/Kb，其中Ka為樣品基質的校準曲線斜率，Kb為溶劑校準曲線的斜率。若ME=100%表明無基質效應，ME為80%～120%為弱基質效應，50%150%表示基質效應強[22]。由表1數據可知，7種蔬菜的ME均在80%～120%，表示雖然存在一定程度的基質效應，但影響不明顯，因此可直接采用空白溶劑配制的標準曲線定量。

2.4.2 線性關系、檢出限與定量下限以百草枯和敵草快的質量濃度為橫坐標(x，μg/L)，對應待測物的定量離子與內標離子峰強度的比值為縱坐標(y)繪制標準曲線。結果顯示，8種基質配制的標準溶液在2～200 μg/L質量濃度范圍內線性良好，相關系數(r)為0.997 2～0.999 6(表1)。以3倍信噪比(S/N=3)計算得百草枯和敵草快在7種蔬菜基質中的檢出限(LOD)分別為1.0～1.5 μg/kg和5.0～7.5 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為3.0～4.5 μg/kg和15～23 μg/kg。本方法的檢出限和定量下限雖遜于文獻報道的LC-MS法[5-6]，但已可滿足主要蔬菜品種中百草枯和敵草快的國家標準限量要求[1]，同時也滿足標準SN/T 0293-2014[19]中的檢出限(百草枯和敵草快的檢出限均為10 μg/kg)要求。

表1 敵草快和百草枯在不同基質溶液中的基質效應(ME)、線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量下限Table 1 Matrix effects(ME),linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of diquat and paraquat in different matrix solution

2.4.3 準確度與精密度分別以上述7種蔬菜空白樣品，進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，按“1.3”方法進行樣品制備，每個濃度設6組平行實驗，其準確度與精密度結果見表2。結果顯示，百草枯和敵草快在7種蔬菜中的回收率分別為73.0%～109%和81.7%～117%，RSD分別為1.0%～8.2%和1.0%～7.0%，表明方法的回收率和精密度均能滿足相關檢測要求。

表2 敵草快和百草枯在7種蔬菜中的加標回收率和相對標準偏差(RSD，n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of Paraquat diquat and paraquat in vegatables (n=6)

圖2 韭菜中添加百草枯和敵草快(100 μg/kg)的質譜圖Fig.2 Mass spectrogram of paraquat and diquat spiked in garlic chives (100 μg/kg)

2.5 實際樣品測定

采用本文建立的方法對當地市場隨機購買的7種蔬菜共14份樣品中百草枯和敵草快進行快速檢測，其中冬瓜、黃瓜、小白菜、上海青、韭菜、芹菜和生菜各2份，均未檢出百草枯和敵草快。圖2為韭菜基質中添加100 μg/kg百草枯和敵草快的質譜圖。

3 結 論

本研究以含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑，建立了蔬菜中百草枯和敵草快的MALDI-FTICR-MS檢測方法，該方法于在30 min內即可獲得測樣結果，具有操作簡單、分析速度快和靈敏度高等優點，對于基質復雜的樣品無需經過凈化處理，提取后即可直接快速測定樣品中痕量的百草枯和敵草快，有望實現復雜生物樣品中百草枯和敵草快的快速、高通量、高靈敏分析和檢測。