氣相色譜-質譜法檢測益智藥材中16種多環芳烴

孫細珍,杜佳煒，錢全全，吳平谷

(1.中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435100；2.浙江省疾病預防控制中心， 浙江 杭州 310051)

PAHs的測定屬于痕量分析，監測指標較多、理化性質差異大、檢測難度較大。已有文獻報道的PAHs檢測方法多集中于土壤、水、空氣以及燒烤食品等方面[13-16]，對于中藥材等復雜基質樣品中PAHs殘留量測定方面的研究報道較少。目前PAHs檢測中常用的樣品前處理方法主要有液液萃取技術、皂化法、凝膠滲透色譜法、固相萃取法、柱凈化-萃取聯用技術[17-21]等凈化方法，GB 5009.265-2016《食品安全國家標準 食品中多環芳烴的測定》中提供的檢測方法不能有效分離苯并[j]熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽，且油脂凈化效果較差[22]。益智藥材因含有大量的揮發油而導致基質復雜，凈化效果不佳時會嚴重影響目標物的測定重復性和準確度，因此需要建立一種凈化效果良好、選擇性強、檢出限低的檢測方法監測益智藥材中的PAHs。

本文采用液液萃取法提取樣品中的多環芳烴，通過聯合使用皂化法和固相萃取法對提取液進行凈化處理，進一步采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和稀釋同位素內標法同時測定益智藥材中的16種多環芳烴。該方法具有提取效率高、凈化效果好的特點，能有效降低益智藥材中復雜基質對多環芳烴目標物的干擾，具有較高的選擇性、靈敏度、準確性，已成功應用于市售益智藥材中16種多環芳烴的監控篩查。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

8批益智藥材購自全國各藥店，編號分別為YZ-1、YZ-2、YZ-3、YZ-4、YZ-5、YZ-6、YZ-7、YZ-8，所有樣品均在陰涼、避光處儲存。

固相萃取凈化柱：二乙烯基苯聚合物+N-丙基乙二胺柱(DVB+PSA，500 mg/6 mL)、弗羅里硅土柱(Florisil，2 000 mg/12 mL)均購自杭州福?？萍加邢薰荆环肿佑≯E柱(MIP，500 mg/6 mL)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

PAHs標準溶液的配制：以丙酮-異辛烷(1∶1，體積比)為溶劑，將16種PAHs混標母液稀釋成0.2 mg/L的標準儲備液，7種PAHs同位素內標混合溶液稀釋成4 mg/L的內標使用液，于4 ℃保存備用；采用丙酮-異辛烷(1∶1，體積比)稀釋PAHs標準儲備液，制備PAHs的系列標準曲線工作液(1、2、4、10、20、50、100、200 μg/L)。

1.2 儀器與設備

8890-5977B 氣相色譜質譜儀(配EI源with XTR，美國Agilent科技有限公司)；SPE-40自動固相萃取儀(天津伯納艾杰爾公司)；搖擺式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；3K15高速離心機(美國Sigma司)；PURELAB Ultra超純水機(英國埃爾格公司)；EFAA-DC24-RT氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)；SQP千分之一電子天平(德國Sartorius公司)；DB-EUPAH毛細管色譜柱(20 m×0.18 mm，0.14 μm，美國Agilent科技有限公司)。

1.3 樣品前處理

取2.0 g益智藥材樣品(過三號篩)于50 mL離心管中，加入10 μL內標使用液，加入20 mL乙醇水溶液(1∶1，體積比)溶解后，再以10 mL正己烷超聲提取5 min，在8 000 r/min下離心5 min。提取液先過Florisil柱固相萃取，用5 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1∶4，體積比)洗脫，洗脫液于40 ℃水浴下氮吹至近干，用3 mL 0.3 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液溶解，加入4 mL水和5 mL正己烷，在8 000 r/min下離心5 min。取有機相過MIP柱進行固相萃取，用5 mL二氯甲烷-乙酸乙酯溶液(1∶1，體積比)進行洗脫，收集洗脫液，在40 ℃水浴中用氮氣緩慢吹干后，準確加入0.2 mL丙酮-異辛烷溶液(1∶1，體積比)，供GC-MS測定。樣品前處理過程見圖1。

圖1 供試樣品前處理流程Fig.1 Preprocessing flow for the test samples

1.4 色譜-質譜條件

色譜條件：DB-EUPAH毛細管色譜柱(20 m×0.18 mm，0.14 μm)；進樣口溫度為280 ℃，載氣為高純氦氣(純度為99.999%)，流速為0.8 mL/min；升溫程序為初溫80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至315 ℃，保持5 min，最后以20 ℃/min 升至320 ℃，保持5 min；進樣體積為2 μL，不分流進樣。

質譜條件：電離源為EI with XTR源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，溶劑延遲為16.5 min，離子掃描范圍為35～500 u。掃描方式：先采用全掃描模式(SCAN)確定16種PAHs與對應內標物(ISTD1、ISTD1……、ISTD7)的保留時間及特征離子，然后對目標化合物進行分組，采用選擇離子模式(SIM)掃描，16種PAHs和7種內標物的保留時間、特征離子及SIM模式分組信息見表1。

表1 16種多環芳烴的色譜-質譜參數Table 1 GC-MS parameters for 16 PAHs

1.5 數據分析

應用SPSS 22.0對不同樣本之間的最小顯著差異進行單因素分析，α≤0.05被認為具有統計學差異；使用Origin 8.6對數據進行說明。

圖2 16種PAHs混合標準溶液(200 μg/L) 的色譜圖(SIM)Fig.2 Chromatogram of 16 PAHs mixture standard in SIM mode 1.BcFL；2.D12-BaA；3.BaA；4.D12-CHR；5.CHR； 6.CPP；7.MCH；8.D12-BbFA；9.BbFA；10.BkFA； 11.BjFA；12.D12-BaP；13.BaP；14.D12-IP； 15.D14-DBahA；16.IP；17.DBahA； 18.D12-BghiP；19.BghiP；20.DBalP； 21.DBaeP；22.DBaiP；23.DBahP

2 結果與討論

2.1 氣相色譜-質譜條件的優化

16種PAHs存在同分異構體現象，為獲得良好的分離度和靈敏度，本研究對升溫程序、柱流速、進樣體積等儀器條件進行了優化(見“1.4”)。在優化條件下，16種PAHs與7種PAHs同位素內標物的SIM模式掃描圖如圖2所示。

2.2 萃取溶劑的選擇

益智藥材含有大量的揮發油且化學成分多樣，而待測的16種PAHs極性范圍寬、結構差異大，通常采用正己烷、二氯甲烷、環己烷、乙酸乙酯或其混合物作為提取溶劑[23]，為了降低基質干擾，本實驗參照文獻[24]考察了正己烷、環己烷-乙酸乙酯(1∶1，體積比)和乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，體積比)共3種溶劑體系的提取效果，實驗結果如圖3所示。從圖中可知，以乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，體積比)為提取溶劑時，16種PAHs的提取回收率為85.4%～108%，優于另外兩種溶劑體系。因此本實驗選擇乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，體積比)作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇

由于益智藥材基質復雜，檢測過程中會產生較大的干擾峰，影響檢測結果的靈敏度與準確度，因此凈化是PAHs檢測過程中的關鍵步驟。本實驗分別對比DVB+PSA柱和MIP柱對加標量為10 μg/kg的16種PAHs的凈化效果，結果如圖4所示。從圖可知，16種PAHs經DVB+PSA柱凈化后的回收率為43.5%～123%，在MIP柱的回收率為78.1%～105%。結果表明DVB+PSA柱對部分PAHs具有基質增加效應，導致回收率過高。因此，本實驗選擇MIP柱作為凈化柱。

圖3 不同提取溶劑對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.3 Effects of different solvents on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

圖4 不同萃取小柱對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.4 Effects of different SPE columns on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

實驗過程中發現樣品經皂化后再采用MIP柱進行凈化處理，樣液顏色較深，不僅對儀器系統產生較大的污染，而且存在一定的基質效應，影響檢測結果的準確度，因此擬在皂化前增加Florisil凈化步驟。本實驗以益智藥材為研究對象，通過對16種PAHs的加標回收實驗(加標量為10 μg/kg)，對在皂化步驟前是否增加Florisil凈化進行考察，實驗結果如圖5所示。從圖可知，不進行Florisil柱凈化時，16種PAHs的回收率為66.4%～139%。進行Florisil柱凈化時，16種PAHs的回收率為85.4%～108%，且譜圖的雜質峰數量明顯減少，雜質響應顯著降低。結果表明增加Florisil固相萃取可以提高凈化效果，獲得更佳的實驗結果。因此，本研究確定在皂化前先進行Florisil柱固相萃取。

2.4 基質效應的評價

基質效應是指樣品中除分析物以外的組分對檢測過程有顯著的干擾，并影響分析結果的準確性。本研究采用Matuszewski等[25]建立的方法評價基質效應，即將同濃度的陰性基質標準溶液目標物響應值與純溶劑標準溶液目標物響應值進行比較，比值等于1時，表明不存在基質效應；比值大于1時，表明存在基質增強作用；比值小于1時，表明存在基質抑制作用；比值介于0.8～1.2時，通常認為基質效應較弱，可以忽略[26]。實驗選取陰性益智藥材試樣，按“1.3”處理后的基質樣液分別配制質量濃度為50 μg/L和200 μg/L的基質混合標準溶液，與同濃度的純溶劑混合標準溶液進行檢測比較。結果表明，經Florisil-皂化-MIP聯合凈化后的兩種樣品基質中，16種PAHs目標物的比值為0.8～1.2，說明本方法的基質干擾較小，基質效應可忽略。

圖5 Florisil凈化柱對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.5 Effects of Florisil SPE column on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

2.5 線性關系與檢出限

在優化條件下，測定系列混合標準工作液，以各PAHs定量離子與對應內標物定量離子的峰面積比作縱坐標(y)，以相應的質量濃度比作橫坐標(x,μg/L)繪制標準曲線，得到各PAHs的線性方程。以3倍信噪比(S/N=3)計算儀器檢出限(LOD)，結合前處理條件的稀釋倍數，確定方法的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)。實驗結果見表2，16種PAHs在1.0～200.0 μg/L的質量濃度范圍內線性良好，相關系數均大于0.99。4種二苯并芘的LOD為1.0 μg/kg，LOQ為3.0 μg/kg，其它12種PAHs的LOD為0.3 μg/kg，LOQ為1.0 μg/kg。

表2 16種PAHs的線性方程、r2、方法檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of 16 PAHs

2.6 回收率與相對標準偏差

在優化條件下，選取益智藥材樣品YZ-4分別進行3個水平(LOQ，2×LOQ，10×LOQ)的加標回收和精密度實驗，以中間添加水平連續實驗3 d，考察方法的日間精密度。由表3可知，在加標濃度范圍內，除苯并[c]芴(BcFL)的加標回收率為65.4%～72.8%，日內相對標準偏差(RSD，n=6)為6.0%～7.4%，日間RSD(n=6)為8.5%外，其他15種PAHs的加標回收率為89.3%～116%，日內RSD(n=6)為0.10%～6.1%，日間RSD(n=6)為1.2%～7.5%。結果表明，該方法準確可靠，可用于益智藥材中16種PAHs的檢測分析。

表3 16種PAHs的回收率與相對標準偏差Table 3 Determination results of recoveries and RSDs of 16 PAHs

2.7 實際樣品的檢測

將采集的8個益智藥材樣品(YZ-1～YZ-8)，采用本實驗建立的方法測定16種PAHs的含量，結果如表4所示。從表中可知，8批益智藥材樣品中YZ-7和YZ-8中存在較高的PAHs，YZ-7樣品中BaP含量為9.05 μg/kg，PAH4(BaA、CHR、BbFA、BaP的總含量)為128.66 μg/kg；YZ-8樣品中BaP含量為9.90 μg/kg，PAH4含量為139.61 μg/kg。表明益智藥材中存在較為嚴重的多環芳烴污染，鑒于所采益智藥材樣品中普遍檢出PAHs化合物，需對益智藥材開展PAHs化合物污染調查，如干燥方式的風險評估等。

表4 8批益智藥材中的PAHs殘留量結果(μg/kg)Table 4 Detection results of PAHs residues in 8 batches of Alpinia oxyphylla Miq samples(μg/kg)

*means the result below the LOD;PAH4 is the sum of contents of 4 kinds PAHs including BaA,CHR,BbFA and BaP

3 結 論

本文采用Florisil-皂化-MIP固相萃取柱聯合凈化技術，建立了氣相色譜-質譜-稀釋同位素內標法同時測定益智藥材中16種PAHs的新方法。通過對儀器條件、萃取溶劑、固相萃取小柱及凈化流程的優化，極大地降低了基質效應對檢測結果的影響。在優化實驗條件下，該檢測方法在1.0～200.0 μg/L范圍內線性關系良好，r2均大于0.99。所建立的方法凈化效果良好，能有效降低復雜樣品基質對檢測結果的影響，方法的靈敏度與準確度高，適用于益智藥材中PAHs的檢測，可參考用于其它植物性中藥材中16種PAHs的測定。