血漿miR-150及miR-200在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的表達及其臨床意義

肖 華 卓 芬 黃娟娟（三亞中心醫(yī)院檢驗科，三亞 572000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種多發(fā)于青年女性的自身免疫介導(dǎo)的經(jīng)典的結(jié)締組織病，累及皮膚、漿膜、關(guān)節(jié)、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，可導(dǎo)致患者多系統(tǒng)損害［1］。傳統(tǒng)實驗室指標(biāo)，如抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體，補體C3、C4、血沉（ESR）及C反應(yīng)蛋白（CRP）等，靈敏度和特異度不高，且其檢測結(jié)果影響因素較多，尚不能成為診斷SLE的最佳標(biāo)志物。因而，尋找能夠在SLE患者體內(nèi)特異表達的生物標(biāo)志物，對SLE的輔助診斷及病情評估尤為重要。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度在21～25 nt的非編碼RNA，通過促進細(xì)胞活化、分化、凋亡、代謝及信號傳導(dǎo)等機制調(diào)節(jié)機體免疫功能和炎癥反應(yīng)狀態(tài)，從而在SLE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2-3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-150及miR-200通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化與信號傳導(dǎo)等過程，參與自身免疫疾病的病理生理過程，可能作為潛在的生物標(biāo)志物［4-5］。本研究通過檢測SLE患者 血漿miR-150及miR-200表 達 水平，分析miR-150及miR-200對SLE的診斷價值，旨在為SLE的診斷及靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2017年1月1日至2019年6月30日海南省第三人民醫(yī)院收治的SLE患者120例，其中男性18例，女性102例，年齡19～64歲，平均（36.20±8.74）歲。采用SLE病情活動指數(shù)（sys?temic lupus erythematosus disease activity index，SLE?DAI）評分評估疾病活動度，其中低活動組56例（SLEDAI評分＜9分），高活動組64例（SLEDAI評分≥9分）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①SLE的診斷參考美國風(fēng)濕病學(xué)會（American College of Rheumatology，ACR）2009年修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)；②臨床試驗室資料完整，能配合本次研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性或慢性炎癥疾病、急性腎損傷、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重心、腦、腎等原發(fā)性疾病及其他自身免疫性疾病者；②近1個月內(nèi)服用過免疫抑制劑、激素及妊娠、哺乳期婦女。另選取50例健康志愿者作為對照組，其中男性11例，女性39例，年齡18～63歲，平均（35.70±9.28）歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒購自美國Ambio公司；ELISA檢測試劑購自上海科新生物技術(shù)股份有限公司。實驗引物由廣東銳博公司合成。miR-150引物：正向引物5'-ACAGTCGTCATCAGTGT?GCT-3'，反向引物5'-GAGTCTAGGGTCGTAGAC-3'；miR-200引物：正向引物5'-GTCAGCTAACTGACT?GCTCG-3'，反向引物5'-ATGTACACTGAATAGTCG-3'；U6：正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測 所有研究對象均抽取空腹靜脈血3 ml置于EDTA抗凝管，離心分離血漿，-80℃低溫冰箱保存待測。試劑盒提取RNA，實時熒光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）檢測。以U6為內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5μl RNA模板，3μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15μl 100 mmol/L的脫氧核糖核苷酸（dNTPs），1.00μl逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μl），1.50μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19μl RNase抑制劑（20 U/μl），4.16μl無菌三蒸水。PCR總反應(yīng)體系為15μl，反應(yīng)條件：16℃30 min、42℃30 min、85℃5min。以U6為實驗內(nèi)參，反應(yīng)體系為20μl：1μl引物及探針Mix（20×），10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67μl無核酸酶水。擴增條件為：95℃10 min 1個循環(huán)，95℃15 s、60℃60 s進行45個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。每個反應(yīng)體系中熒光信號達到所設(shè)定的閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-150及miR-200表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.2 實驗室相關(guān)指標(biāo)檢查ELISA法檢測抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體含量，ESR使用魏氏法，血沉架手工檢測；血清白蛋白（ALB）、補體C3、補體C4及CRP水平在貝克曼全自動生化分析儀上檢測，操作過程均嚴(yán)格按照儀器及配套試劑說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩獨立樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗。計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征曲線分析血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平對SLE的診斷價值，曲線下面積（area under curve，AUC）的比較采用Z檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料及實驗室指標(biāo)比較SLE組、高活動組和低活動組抗dsDNA抗體、ESR及CRP水平均明顯高于對照組（P＜0.05），且高活動組SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平均明顯高于低活動組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SLE組、高活動組和低活動組C3、C4及ALB水平均明顯低于對照組（P＜0.05），且高活動組ALB水平明顯低于低活動組（P＜0.05）；而高活動組和低活動組ESR、C3、C4及CRP水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）各組間性別、年齡及體質(zhì)指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組一般資料及實驗室指標(biāo)比較（±s）Tab.1 Comparison of general data and laboratory indexes of each group（±s）

表1 各組一般資料及實驗室指標(biāo)比較（±s）Tab.1 Comparison of general data and laboratory indexes of each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with low activity group，2）P＜0.01.

CRP（mg/L）3.25±1.06 10.72±4.281）13.90±5.271）12.62±4.511）3.850 0.020 Groups n Control Low activity High activity SLE 50 56 64 120 F P Male/female 11/39 7/49 11/53 18/102 0.352 0.518 Age（years）35.70±9.28 35.84±8.36 36.50±9.13 36.20±8.74 0.728 0.436 SLEDAI score-7.40±1.90 13.25±4.361）2）10.62±3.24 9.714＜0.01 Anti dsDNA antibody（U/ml）33.75±5.84 240.36±57.201）308.42±71.601）2）280.74±63.501）10.260＜0.001 ESR（mm/h）8.40±2.70 38.64±9.151）42.35±11.731）40.72±9.831）3.586 0.037 C3（g/L）1.16±0.35 0.68±0.241）0.63±0.211）0.65±0.201）4.217 0.012 C4（g/L）0.38±0.14 0.19±0.101）0.16±0.071）0.17±0.081）3.815 0.024 ALB（g/L）48.26±7.93 34.60±6.451）26.84±5.711）2）30.17±5.831）6.193＜0.001

2.2 各組血漿miR-150及miR-200表達水平比較SLE組、高活動組和低活動組血漿miR-150及miR-200表達水平均明顯低于對照組（P＜0.01），且高活動組血漿miR-150及miR-200表達水平明顯低于低活動組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組血漿miR-150及miR-200表達水平比較（±s）Tab.2 Comparison of expression levels of miR-150 and miR-200 in each group（±s）

表2 各組血漿miR-150及miR-200表達水平比較（±s）Tab.2 Comparison of expression levels of miR-150 and miR-200 in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with low ac?tivity group，2）P＜0.01.

miR-200 2.27±0.56 1.34±0.201）0.52±0.061）2）0.91±0.181）11.825＜0.01 Groups Control Low activity High activity SLE n 50 56 64 120 F P miR-150 1.73±0.38 0.81±0.151）0.22±0.031）2）0.48±0.051）14.713＜0.01

2.3 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平對SLE的診斷價值 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平診斷SLE的最佳截斷值分別為0.54、0.97、195.40 U/ml，三項聯(lián)合診斷SLE的曲線下面積明顯高于單項miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=4.215，4.903、5.174，P＜0.05），其敏感度和特異度為92.5%和86.3%。見表3和圖1。

表3 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平對SLE的診斷價值Tab.3 Diagnostic value of plasma miR-150，miR-200 and anti dsDNA antibody levels in SLE

圖1 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平診斷SLE的ROC曲線Fig.1 ROC curve of diagnosing SLE with plasma miR-150，miR-200 and anti dsDNA antibody levels

2.4 血漿miR-150及miR-200表達水平與實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示，SLE患者血漿miR-150及miR-200表達水平與SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001），而血漿miR-150及miR-200表達水平與C3、C4、ALB及CRP水平均無明顯相關(guān)（P＞0.05）。見表4。

表4 血漿miR-150及miR-200表達水平與實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.4 Analysis of the correlation between the expression level of miR-150 and miR-200 in plasma and labo-ratory indexes

3 討論

miRNA是近年來廣受關(guān)注的重要的基因表達調(diào)控因子，在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。SLE的免疫發(fā)病機制與B細(xì)胞過度激活和特異性自身抗體產(chǎn)生有關(guān)，而miRNA的表達水平與外周B細(xì)胞分布改變有關(guān)，其通過對免疫細(xì)胞分化與信號傳導(dǎo)等過程調(diào)節(jié)激活B細(xì)胞表達，從而參與SLE的發(fā)生發(fā)展［6］。在SLE患者中，某些miRNA異常表達導(dǎo)致其調(diào)節(jié)的多個靶蛋白異常累積，導(dǎo)致活化信號的級聯(lián)放大，從而參與SLE的發(fā)病過程，改變SLE患者體內(nèi)miRNA表達水平可作為潛在的治療手段［7］。miR-150分布于B、T細(xì)胞，目標(biāo)基因是轉(zhuǎn)錄因子c-myb，功能是抑制B、T細(xì)胞的活性和增生，在B細(xì)胞中，miR-150導(dǎo)致c-myb水平降低，并阻止B細(xì)胞成熟，在SLE患者中表達下降，與SLE活動度呈負(fù)相關(guān)［8］。miR-200作為轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)控細(xì)胞活動各個階段，從分裂到增生到凋亡，可通過影響DNA甲基化及TLR信號通道等多個環(huán)節(jié)調(diào)控各種免疫細(xì)胞亞群分化及功能，在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。

本研究顯示，SLE組、高活動組和低活動組抗dsDNA抗體水平均明顯高于對照組，且高活動組SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平均明顯高于低活動組，而SLE組、高活動組和低活動組血漿miR-150及miR-200表達水平均明顯低于對照組，且高活動組血漿miR-150及miR-200表達水平明顯低于低活動組。提示miR-150及miR-200在SLE患者中異常低表達，且與SLE活動度相關(guān)，其水平降低可能預(yù)示疾病活動度較高。相關(guān)分析也顯示，SLE患者血漿miR-150及miR-200表達水平與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān)，進一步提示血漿miR-150及miR-200表達水平與SLE患者病情惡化有關(guān)，可能作為監(jiān)測SLE患者病情的參考指標(biāo)。REKVIG等［10］研究顯示，抗ds?DNA抗體在SLE患者中高表達，其對診斷SLE有一定的價值，與SLE的活動度相關(guān)，并可作為SLE療效評估的參考指標(biāo)。WANG等［11］研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者miR-200水平明顯低于健康對照組，與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān)，可能參與SLE的發(fā)病機制，未來有望作為SLE的生物標(biāo)志物。本研究應(yīng)用ROC曲線分析，血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平診斷SLE的最佳截斷值分別為0.54、0.97、195.40 U/ml，三項聯(lián)合診斷SLE的曲線下面積最大，其敏感度和特異度較好。說明miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體三項聯(lián)合檢測有助于提高診斷SLE的準(zhǔn)確性。相關(guān)分析也顯示，SLE患者血漿miR-150、miR-200表達水平與抗dsDNA抗體水平呈負(fù)相關(guān)，進一步提示三項聯(lián)合檢測對診斷SLE具有較高的臨床價值。NAKHJAVANI等［12］研究顯示，與健康對照組相比，狼瘡性腎炎患者血漿miR-150表達水平顯著降低，參與了腎纖維化的發(fā)生，可能作為診斷狼瘡性腎炎的潛在生物標(biāo)志物。ZHANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，狼瘡性腎炎患者血漿miR-200表達水平降低，與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān)，且miR-200表達升高是預(yù)測狼瘡性腎炎發(fā)病的獨立保護因子，可作為狼瘡性腎炎診斷的新型標(biāo)志物。LI等［14］研究認(rèn)為，SLE患者血清miR-203水平明顯降低，與抗dsD?NA抗體和SLEDAI評分相關(guān)，對SLE的鑒別診斷和判斷疾病活動度有一定價值。另有研究表明，SLE患者血漿miR-92a表達水平下調(diào)可能與其發(fā)病和病情進展相關(guān)，可以作為SLE臨床診斷的新型生物學(xué)指標(biāo)［15］。

綜上所述，SLE患者血漿miR-150及miR-200表達水平明顯降低，且與SLE病情活動度相關(guān)，聯(lián)合抗dsDNA抗體檢測對SLE診斷具有一定價值，同時也為了解SLE的發(fā)病機制提供了新的見解。但這些研究仍處于初步探索階段，今后尚需更多研究進一步證實miR-150及miR-200在SLE中的臨床應(yīng)用價值，使其為臨床提供更豐富的SLE診療體系。