姜黃素通過激活AMPK信號通路介導的自噬抑制大鼠蛛網膜下腔出血后神經元凋亡①

羅 焱 張 平 （南華大學附屬南華醫院神經內科，衡陽421002）

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種由多原因所致腦表面或底部腦血管破裂后血液流入蛛網膜下腔而引起的中樞神經系統疾病。SAH后可出現多種嚴重并發癥，如早期腦損傷（early brain injury，EBI）、急性腦血管痙攣、血腦屏障、遲發性腦缺血等，且還具有較高的發病率、致殘率和致死率［1-2］。既往研究認為，EBI是導致SAH患者死亡和不良預后的重要原因，而神經元凋亡則被認為是引起EBI的重要病理機制［3-5］。此外，作為真核生物中高度保守的一類生物學途徑，自噬可通過降解細胞內組分維持細胞穩態，在感染、癌癥、神經退行性變、衰老和代謝紊亂相關的多種疾病中起著關鍵作用。既往研究表明，SAH后的自噬激活對EBI具有神經元保護作用［6-7］。姜黃素（curcumin，Cur）是一種從姜黃中分離出的天然二酮類化合物，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多重藥理學作用。多項研究表明，Cur是一種天然的自噬調節劑，能夠通過激活自噬抑制細胞凋亡［8-9］。同時，已證實Cur對SAH后腦血管痙攣、EBI、血腦屏障等具有神經保護作用［10-12］。然而，Cur是否通過激活自噬發揮SAH后神經保護作用，目前鮮有報道。因此，本研究擬采用血管內穿刺法建立大鼠SAH模型，探究Cur對SAH后神經元凋亡及自噬的影響，并初步闡明其機制，旨在為臨床中藥防治SAH后神經損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，鼠齡7～8周，體重250～300 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物飼養合格證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.1.2 主要試劑 姜黃素（純度99%）購自河南科銳化工有限公司；AMPK抑制劑Dorsomorphin購自美國Med Chem Express公司；TUNEL染色試劑盒購自上海碧云天生物工程有限公司；兔抗cleaved-cas‐pase-3多克隆抗體、兔抗Beclin-1單克隆抗體、小鼠抗LC3-Ⅱ多克隆抗體、兔抗Phospho-AMPKα（Thr 172）單克隆抗體、兔抗AMPKα單克隆抗體、兔抗Phospho-mTOR（Ser2448）單克隆抗體、兔抗mTOR多克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、熒光二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488）以及Goat Anti-Rabbit IgGH&L（Alexa Fluor?594）均購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗NeuN熒光單克隆抗體（Alexa Fluor?594 Conjugate）購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔、小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型構建 將60只SD雄性大鼠隨機分成5組，假手術組（Sham）、模型組（SAH），Cur低劑量干預組（50 mg/kg，Cur-L）、Cur高劑量干預組（200 mg/kg，Cur-H）和高劑量Cur聯合AMPK抑制劑Dorsomorphin干預組（200 mg/kg Cur+25 mg/kg Dorsomorphin，Cur-H+Dor），每組12只。采用血管內穿刺法建立大鼠SAH模型，以穿刺后有明確無腦實質損害的SAH或血凝塊作為模型制備成功標準［13］。其中Sham組不刺破血管壁，其余操作均一致。術后Cur干預組立即給予側腦室注射給藥，Cur-H+Dor組在Cur給藥結束后給予側腦室注射25 mg/kg Dorsomorphin，Sham與SAH組給予注射等量生理鹽水，1次/d，連續3 d。

1.2.2 大鼠神經功能缺損評分及腦含水量檢測 給藥治療3 d后，參考YAMAGUCHI等［14］方法對各組大鼠進行神經損傷缺損評分，總分24分，神經功能缺失越嚴重得分就越低，具體評分項目包括：①自主運動；②肢體本能反應；③觸須反應；④前爪的伸展性；⑤攀爬運動能力；⑥四肢運動的平衡性。各組隨機抽取5只大鼠，斷頭處死后取腦組織，使用濾紙將缺血側腦組織表面水分小心擦拭，稱其濕重后將其置于100℃烘箱內烘烤至恒重，然后稱其干重，計算各組大鼠腦組織含水量。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.3 TUNEL法檢測海馬組織神經元凋亡情況取各組1.2.2后剩余大鼠，于術后3 d斷頭取腦并分離海馬組織，取部分海馬組織經4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋后切片、脫蠟，滴加不含DNase的蛋白酶K在37℃條件下孵育15 min，用PBS洗滌3次，再滴加3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，用PBS洗滌3次，按要求滴加生物素標記液，37℃孵育60 min，PBS洗滌1次終止反應，最后滴加DAB顯色液室溫孵育20 min，蘇木精染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。細胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細胞。每張切片選擇6個高倍鏡視野計數600個細胞，凋亡率以600個細胞中陽性細胞百分比表示。

1.2.4 免疫熒光染色觀察LC3-Ⅱ在神經元中的分布及表達 取部分已采用4%多聚甲醛固定的海馬組織，放入20%蔗糖溶液中至組織沉到瓶底，包埋后切片，每連續5片取1片用于組織免疫熒光染色。取出切片，采用10%山羊血清室溫封閉1 h，分別加入兔抗LC3-Ⅱ抗體（1：100）和小鼠抗NeuN抗體（1：50），4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，分別加入二抗Goat Anti-Mouse IgGH&L（Alexa Fluor?488）和Goat Anti-Rabbit IgGH&L（Alexa Fluor?594）室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，加入防淬滅劑后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，以LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強度表示LC3-Ⅱ蛋白顆粒形成水平。

1.2.5 Western blot檢測大鼠腦組織中相關蛋白表達水平 取大鼠部分凍存海馬組織，加入RIPA裂解液，冰上充分研磨20 min，4℃條件下12 000/rmin離心20 min，留取上清液，使用BCA法進行蛋白定量。取30μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBST洗滌3次，分別加入cleaved-cas‐pase-3抗體、Beclin-1抗體、LC3-Ⅱ抗體、p-AMPKα抗體、AMPKα抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體和GAPDH抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔或小鼠IgG，室溫孵育30 min，PBST洗滌3次，滴加ECL發光顯影。采用Image J測定蛋白條帶的光密度并進行定量分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0統計軟件進行統計分析，計量資料用±s表示，多組間比較用One Way ANOVA方法，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cur對SAH大鼠神經功能及腦組織水腫的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠神經功能評分顯著降 低（P＜0.001），腦 組 織 含 水 量 顯 著 增 加（P＜0.001）；與SAH組比較，Cur-H組大鼠神經功能評分顯著增加（P＜0.001），腦組織含水量顯著降低（P＜0.001），而Cur-L組與SAH組比較無顯著性差異（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠神經功能評分顯著降低（P＜0.001），腦組織含水量顯著增加（P＜0.05），如圖1所示。

2.2 Cur對SAH大鼠海馬組織神經元凋亡的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中cleaved-caspase-3蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.001）；與SAH組比較，Cur-H組大鼠海馬神經元凋亡率以及cleaved-caspase-3蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.001），Cur-L組無顯著性差異（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠海馬神經元凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著增加（P＜0.001），如圖2、3所示。

2.3 Cur對SAH大鼠海馬組織自噬水平的影響與Sham組比較，SAH組大鼠海馬區LC3-Ⅱ蛋白熒光信號減弱（P＜0.001），Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達顯著下調（P＜0.05）；與SAH組比較，Cur-H組大鼠海馬區LC3-Ⅱ蛋白熒光信號增強（P＜0.001），Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達顯著上調（P＜0.001），而Cur-L組無顯著性變化（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠海馬區LC3-Ⅱ蛋白熒光信號減弱，Be‐clin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達顯著下調（P＜0.05），如圖4、圖5所示。

圖1 各組大鼠神經功能評分和腦組織含水量比較Fig.1 Comparison of neurological score and brain water content of rats in each groups

圖2 TUNEL染色（×400）Fig.2 TUNEL staining（×400）

圖3 各組大鼠海馬組織中Cleaved-caspase-3表達水平Fig.3 Expressions level of Cleaved-caspase-3 in hippo?campal tissues of rats in each group

圖4 各組大鼠海馬組織LC3-Ⅱ蛋白免疫熒光染色（×400）Fig.4 Immunofluorescence staining of LC3-Ⅱprotein in hippocampal tissues of rats in each group（×400）

2.4 Cur對SAH大鼠海馬組織AMPK信號通路相關蛋白表達的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠海馬組織p-AMPKα表達水平顯著降低（P＜0.05），pmTOR表達水平顯著升高（P＜0.05），與SAH組比較，Cur-H組大鼠海馬組織p-AMPKα表達水平顯著升高（P＜0.05），而p-mTOR表達水平顯著降低（P＜0.05），而Cur-L組無顯著性變化（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠海馬組織p-AMPKα表達水平顯著降低（P＜0.05），同時p-mTOR表達水平顯著升高（P＜0.05）。而各組總AMPKα和mTOR蛋白水平無顯著性變化（P＞0.05），如圖6所示。

圖5 各組大鼠海馬組織自噬相關蛋白表達Fig.5 Expression level of autophagy related-proteins in hippocampal tissues of rats in each group

圖6 各組大鼠海馬組織中AMPK信號通路相關蛋白的表達Fig.6 Expression of AMPK signaling pathway related proteins in hippocampal tissues of rats in each group

3 討論

自噬即自我吞噬作用，是真核生物特有的生命現象，機體主要通過自噬溶酶體來清除細胞內的毒性物質和受損的細胞器，執行生存或死亡的功能，以維持細胞內環境的穩定。自噬通路在神經退行性疾病、腦缺血再灌注損傷、創傷性腦損傷等多種中樞神經系統疾病中發揮重要作用［15-17］。既往研究表明［18］，SAH后神經元自噬被激活以抑制神經元凋亡，然而這種自噬水平在24 h達到峰值，隨后降低并在48 h恢復正常。自噬可以通過清除受損線粒體，抑制細胞色素

C等凋亡起始因子的釋放，進而抑制細胞凋亡，是應激性細胞損傷的重要保護機制。因此，若適當激活神經元自噬極有可能對SAH后EBI相關神經元凋亡起到抑制作用。而本研究結果發現，Cur干預可顯著提高SAH大鼠神經元自噬水平并抑制神經元凋亡，對SAH大鼠神經功能及腦組織水腫有顯著的改善作用。表明，Cur可以通過增強自噬抑制SAH后早期神經元凋亡。

腦血管破裂后會引起腦血管血流的改變，造成供血區域出現缺血缺氧狀態，進而誘導神經元凋亡，而神經元凋亡恰是導致SAH后EBI的重要病理機制。本研究采用血管內穿刺法建立SAH大鼠模型發現，SAH大鼠海馬組織中神經元凋亡嚴重，cleaved-caspase-3表達水平顯著上調，且神經缺失和腦組織水腫嚴重。而采用Cur干預后，SAH大鼠海馬組織神經元凋亡率顯著下降，海馬組織cleavedcaspase-3表達水平顯著降低，神經缺失和腦組織水腫改善明顯。李霞等［11］研究顯示，Cur可抑制SAH大鼠海馬神經元凋亡，并改善SAH后EBI。說明，Cur能夠抑制SAH后海馬神經元凋亡，改善神經功能。然而，有關Cur抑制SAH后海馬神經元凋亡的潛在機制尚不完善。

細胞凋亡與細胞自噬之間關系錯綜復雜，既相互相成，又相互制約。當細胞受環境壓力較小時，細胞啟動自噬機制克服應激損傷，避免細胞死亡；若環境壓力較大或持續時間較長時，細胞自噬將過度消耗細胞內蛋白和細胞器而使細胞無法繼續生產，繼而啟動凋亡程序并抑制自噬［19］。SAH后短時間內神經元自噬會被激活，適度自噬有利于毒性物質和受損細胞器的清除，能夠促進神經元存活，抑制凋亡［6-7，18］。適度激活神經元自噬可抑制SAH后早期神經元凋亡，而Cur具有激活細胞自噬的作用，因此，Cur有可能通過調節自噬抑制SAH后早期神經元凋亡［8-9］。為了進一步證實，本研究對自噬標志分子LC3-Ⅱ蛋白及自噬啟動因子Beclin-1蛋白進行了檢測，結果顯示Cur干預后能夠顯著提高SAH大鼠海馬組織中Beclin-1。

mTOR是調控自噬的關鍵分子，其激活可抑制自噬，而作為mTOR負調控因子，AMPK的激活可促進自噬［20］。有報道稱，AMPK信號通路參與了SAH后早期腦損傷中神經元自噬的激活［21］。同時也有研究顯示，Cur可通過激活AMPK信號通路誘導細胞自噬［22］。因此，在SAH中Cur極可能通過調控AMPK/mTOR信號通路誘導海馬神經元自噬。為此，本研究對該通路關鍵調控蛋白的磷酸化水平進行了檢測，結果發現Cur可顯著提高SAH大鼠海馬組織中p-AMPK水平，降低p-mTOR水平，而對AMPK和mTOR蛋白表達水平無顯著影響。說明，Cur是通過激活AMPK信號通路誘導海馬神經元自噬。

綜上所述，本研究發現Cur可通過激活AMPK通路誘導海馬神經元自噬，進而抑制神經元凋亡，從而改善SAH大鼠神經損傷，為Cur防治SAH后神經損傷提供了新的實驗依據。