細胞外囊泡調控哺乳動物胚胎附植研究進展

張 蓉，趙 樂，楊海麗，楊永恒，程文強，趙永聚

(西南大學動物科學技術學院 草食動物科學重慶市重點實驗室 重慶市草食動物資源保護與利用工程技術研究中心，重慶 400715)

胚胎附植是指哺乳動物受精卵發育成囊胚定位于子宮，結束游離狀態，與母體子宮建立初步聯系的過程，又稱胚胎著床。它是妊娠建立的關鍵步驟，也是早期胚胎生長發育的重要環節。胚胎附植包括定位、黏附和并置等過程，一旦附植成功，胚胎和子宮內膜會隨著生理狀態的變化而發生形態和結構上的改變，例如：子宮內膜發生增殖、分化，滋養層細胞發生遷移、侵襲，胎盤逐漸發育形成，從而保證母胎之間信息的交流和物質的交換。研究發現，哺乳動物早期胚胎丟失占妊娠失敗的1/3，其中約有75%的胚胎在著床前后發生丟失[1-2]。因此，研究胚胎附植的調控機制對保證哺乳動物成功妊娠和提高哺乳動物繁殖率具有重要意義。

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由真核細胞和原核細胞分泌的膜性囊泡的異質群體[3]，包括外泌體、微囊泡、凋亡小體等[4]。研究發現，細胞外囊泡作為細胞間通訊，廣泛參與機體生理和病理狀態過程，其在配子發生、受精、胚胎附植、胚胎發育及胎盤形成等生殖過程中發揮重要作用。有研究表明，哺乳動物子宮內膜、胚胎、子宮液及胚胎培養基中均存在細胞外囊泡，且自身和攜帶的內容物能夠影響胚胎的生存力和子宮環境[5]。本文主要闡述了細胞外囊泡在哺乳動物胚胎附植中的調控作用，以期為研究細胞外囊泡在哺乳動物胚胎附植中的調控作用提供理論參考。

1 細胞外囊泡及其生物學功能

1.1 細胞外囊泡的形成及組分

細胞外囊泡是一種由內體或質膜脫落而成的膜結合的納米囊泡，其內容物包含蛋白質、DNA、mRNA/miRNA、脂質等，在機體體液，包括血液、尿液、乳汁、子宮液、羊水等[6-9]中廣泛分布，其也可以由細胞分泌產生，如滋養層細胞、子宮內膜上皮細胞、腫瘤細胞、胚胎等[10-13]。由于不同細胞來源分泌的細胞外囊泡形態和組成存在差異，因此，目前對細胞外囊泡并沒有確切的命名。根據細胞來源、大小、形態和內容物含量將細胞外囊泡主要分為兩大類：外泌體(exosomes)和微囊泡(microvesicles，MVs)(表1)。

表1 細胞外囊泡的類型及特征Table 1 Types and characteristics of extracellular vesicles

外泌體作為細胞外囊泡的亞型，它以腔內囊泡(ILV)的形式在內體系統內生成，并在多囊泡體(multivesicular body,MVB)與細胞表面融合的過程中被分泌[14]，蛋白則是細胞外囊泡形成的第一調節器。外泌體膜蛋白從高爾基體到達內體或從質膜內化，然后在內體成熟過程中被分類為ILVs，而這一過程涉及特定的分選機制。這些分選機制中內體分選復合物(ESCRT)機制作為膜成形和剝離的驅動器，揭示MVB和ILV形成機制[15]。它以逐步方式運行，其中ESCRT-0和ESCRT-Ⅰ亞基聚集泛素化跨膜蛋白位于MVB限性膜的微區，并通過ESCRT-Ⅱ吸收能夠萌發和分裂該微區的ESCRT- Ⅲ亞復合物。也有研究表明，可以不依賴于ESCRT機制仍形成以載有CD63的ILV為特征的MVB[16]，這需要神經酰胺、四跨膜蛋白等的參與[17-21]。

微囊泡，起初被發現是來自于正常血漿和血清中血小板的亞細胞物質，稱作“血小板灰塵”[22]。后來發現，受刺激的中性粒細胞經胞吐作用釋放出質膜囊泡[23]。最近有研究發現，它們在不同細胞類型中的細胞間通訊發揮作用，包括癌細胞[24]，通常稱為“脂質體”。它由質膜向外出芽和裂變，隨后釋放到細胞外空間，其具體生物發生機制尚不明確。相關研究發現，它的形成需要質膜內的幾種分子重排，包括脂質成分和蛋白質組成的變化以及Ca2+水平的改變，還需細胞骨架成分及其調節劑[25-27]。它的釋放需要從質膜裂變，這一機制依賴于肌動蛋白和肌球蛋白與ATP依賴性收縮的相互作用[21,28]。

1.2 細胞外囊泡的生物學功能

細胞外囊泡參與機體的多種生理/病理過程：1)參與細胞間通訊：細胞外囊泡攜帶遺傳物質運送到受體細胞影響細胞功能，能夠作為細胞間信息交流和物質交換的載體；2)參與免疫應答：細胞外囊泡被證實能調節細胞免疫[29]；細胞外囊泡含有免疫抑制HLA-G，可調節母體免疫耐受來促進胚胎發育[30]；3)作 為生理/病理標志物：細胞外囊泡包裹的RNA在本質上是其來源細胞的內容物和狀態的寫照，且能夠免于miRNA降解，因此能夠作為生理/病理標志物；4)作為藥物載體：細胞外囊泡可保證治療劑的用量和生物活性，且具有較低免疫抗原性和毒性等特點，可以作為藥物運載工具[31]。

2 細胞外囊泡調控哺乳動物胚胎附植

胚胎附植是一個復雜且動態化的生理過程，涉及到母體子宮與胚泡之間的密切交流和溝通。只有胚泡和子宮經歷同步發育和雙向串擾，建立結構聯系從而保證胚胎成功植入。胚泡由兩種不同類型的細胞組成：形成胚胎的內細胞團(inner cell mass，ICM)和圍繞ICM并最終形成胎盤的滋養外胚層細胞[32-33]，后者負責將胚泡附植于子宮內膜上皮，并進行遷移和侵襲進而植入胚胎。這一過程受到可溶性生長因子、激素、黏附分子和細胞外基質(ECM) 等多種因素的調節，這些因素可以通過自分泌、旁分泌和內分泌方式參與胚胎附植的調控[34]。早期細胞外囊泡被當作是細胞向外界排泄“廢物”的一種途徑，而近年來發現，它能夠介導細胞間信息交流和物質交換。由胚胎干細胞產生的細胞外囊泡能將內含物轉移到滋養層細胞并被其吸收，從而促進胚胎的植入[13]。這進一步說明，細胞外囊泡可將miRNA、蛋白質等物質運輸至相應的受體細胞，從而影響受體細胞的生理功能。

2.1 細胞外囊泡miRNA與胚胎附植

miRNA是長度為19～22 nt的小型非編碼RNA，它最主要靶向mRNA從而引起mRNA的降解或轉錄抑制，調節基因轉錄后表達水平[35-36]。它能參與多種生物學過程，例如配子發生、受精、胚胎發育、著床及胎盤形成[37-38]。有研究表明，miRNA作為細胞外囊泡的主要組成成分，不同細胞來源的細胞外囊泡miRNA不僅可以調控囊胚的分化、生長、發育及炎癥反應，還可以調控子宮內膜細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程[39](表2)。

表2 參與哺乳動物胚胎附植的細胞外囊泡miRNAsTable 2 miRNAs in extracellular vesicles involved in mammalian embryo implantation

胚胎附植是胚胎與子宮內膜相互接觸，建立直接聯系的生物學過程。這一過程會涉及多種分子的參與，從而形成特殊的子宮腔微環境，促使子宮內膜達到最佳容受狀態，來接受活化的囊胚。研究者們檢測了人[40]、豬[41]和綿羊[42]的子宮液發現，細胞外囊泡中包裹著miRNA。Krawczynski等[41]發現，豬子宮腔液中細胞外囊泡攜帶的miR-125b可能通過抑制LIF、LIFR和IL-6R基因的表達，進而介導子宮容受性、免疫、胚胎/滋養細胞發育和著床。然后對植入不同階段小鼠子宮內膜釋放的細胞外囊泡進行miRNA序列分析發現，miR-34c-5p、miR-210、miR-369-5p、miR-30b和miR-582-5p在植入窗口期(WOI)富集，還發現 miR-34c-5p可以通過靶向子宮內膜的生長停滯特異性1(GAS1)，調節子宮內膜容受性，參與胚胎植入過程[43]。Burns等[42]對空懷14 d母羊和妊娠14 d母羊子宮液細胞外囊泡進行高通量測序分析，結果共檢測到53種miRNAs，而僅miR-423在妊娠母羊子宮腔液中被檢測到，生物信息學分析顯示，它廣泛參與細胞代謝、細胞周期和細胞凋亡等生理過程。母體免疫系統也會參與調節母胎免疫的微環境，保證妊娠正常進行，而細胞外囊泡攜帶的miRNA會參與其中并發揮重要作用。研究者將利用附植分離得到的子宮液細胞外囊泡處理牛子宮內膜細胞發現，其攜帶miR-98參與母體免疫功能的調節，促使胚胎成功附植于子宮內膜上皮細胞[44]。

胚胎成功附植，除了需要具有良好容受性的子宮內膜，還需要活化的優質胚胎。在胚胎發育過程中，胚胎的生存環境會影響胚胎的發育，其狀態會影響細胞外囊泡miRNA的釋放。Kropp等[45]檢測了發育成熟的和退化的牛胚胎培養基中的5種miRNAs的表達，發現在退化胚胎中miR-181a、miR-196a2、miR-302c和miR-25的表達水平相對較高。Rosenbluth等[46]發現，胚胎培養液中的miRNA 會根據受精率、染色體狀況和妊娠結局出現差異表達，如miRNA-191在非整倍體胚胎的培養基中濃度較高，miR-191、miR-372和miR-645在IVF/ICSI中高表達。研究者將妊娠階段的小鼠子宮液外泌體與胚泡進行共培養后，提高了囊胚形成率，并且在植入后，miR-21的表達隨著外泌體濃度而上調[47-48]。將來源于卵巢液、羊膜的細胞外囊泡添加到胚胎培養基中發現，其能夠提高胚胎孵化率和植入率，誘導DNA甲基化調控表觀遺傳，參與早期胚胎發育過程，還能夠上調相關miRNAs的表達，如miR-130a、miR-181b和miR-631[49-50]。這些都表明，特異性miRNA的分泌可能與胚胎發育有關，因此，可以通過檢測特異性miRNA來選擇最優質的胚胎，以保證成功妊娠。

在哺乳動物胚胎附植過程中，還涉及到了母胎之間的相互干擾。體外試驗對子宮內膜上皮細胞ECC及其分泌的細胞外囊泡進行miRNA測序分析，其結果顯示，差異表達的227個miRNAs中僅 13種miRNAs存在于細胞外囊泡中，如miR-451、miR-122、miR-124等，并對其靶基因進行生物信息學分析，顯示這些細胞外囊泡miRNA與附植相關的信號通路相互作用，如黏附連接、VEGF信號通路、Jak-STAT通路和toll樣受體信號通路[51]。Vilella等[52]證明，人子宮內膜細胞釋放的外泌體包裹的has-miR-30 d能夠被滋養層細胞攝取并整合到RISC復合體中，參與胚胎附植前轉錄組修飾和胚胎黏附表型，而miR-30 d敲除小鼠顯示，母體和/或胚胎miR-30 d缺乏會在體內損害子宮內膜的接受能力和胚胎植入率[53]，進一步研究發現，異質核糖核蛋白C1(hnRNPC1)可以影響子宮內膜細胞釋放外泌體中的miR-30 d的含量，影響胚胎植入[54]。對11種豬輸卵管上皮細胞來源的細胞外囊泡候選miRNAs進行鑒定，發現僅6種miRNAs(miR-19b，miR-19a，miR-203，let-7a，miR-126和miR-103) 表達，這些miRNAs能夠協助胚胎經過輸卵管進入子宮內膜進行附植[55]。研究者還發現，體外培養的豬滋養外胚層細胞分泌的細胞外囊泡可以攜帶miRNAs(miR-16、miR-17-5p、miR-20a)并能刺激內皮細胞的增殖，參與胎盤血管生成[56]。綜上，細胞外囊泡在妊娠早期母胎之間的相互串擾中發揮著重要的生物學作用。

2.2 細胞外囊泡中其他生物活性物質與胚胎附植

細胞外囊泡中除了攜帶多種miRNAs參與哺乳動物胚胎附植過程，同時還有蛋白質參與其中(表3)。干擾素τ(IFNτ)是反芻動物胚胎及其滋養層細胞分泌的一種細胞因子，它通過旁分泌的方式減少雌激素和催產素受體在子宮內膜的表達，從而維持黃體活化和孕激素的產生[57]。研究者發現，子宮腔液外泌體攜帶的母體釋放的內源性逆轉錄病毒(endogenous jaagsiekte retroviruses，enJSRV)通過誘導TLR信號通路刺激滋養層細胞增殖并釋放IFNτ，參與胚胎附植和免疫應答[58]。

表3 參與哺乳動物胚胎附植的細胞外囊泡蛋白質Table 3 Proteins in extracellular vesicles involved in mammalian embryo implantation

不同生理階段的細胞外囊泡所攜帶的蛋白質存在差異，且這些蛋白質可以影響受體細胞的生物學功能。研究者對不同生理階段綿羊子宮腔液中的細胞外囊泡進行質譜分析，鑒定出195種蛋白質，其中40種和76種分別特異性表達于非妊娠和妊娠母羊子宮液細胞外囊泡，究其來源，發現其中部分蛋白是由子宮內膜上皮細胞/滋養層細胞分泌[42]。Nakamura等[59]對妊娠第15、17天和空懷第15、17天的牛子宮液外泌體進行蛋白組學分析發現，CAPG、AKR1BI和IFNτ僅在妊娠階段表達，推測它們可能是由胚胎分泌到子宮腔液后經外泌體運送到子宮組織參與胚胎附植的調控因子。此外，有研究者將妊娠第17、20和22天的牛子宮腔液外泌體與滋養層TC-1細胞和子宮內膜上皮細胞共培養，結果發現,凋亡及黏附相關基因表達水平顯著升高[60]。

Greening等[61]發現，特定激素治療后,子宮內膜癌細胞(ECC1)衍生的外泌體能增強滋養層細胞的黏附能力，相關蛋白表達顯著增加，這些蛋白參與胚胎黏附、遷移、侵襲和細胞外基質重塑等植入的基本過程[61-62]。Desrochers等[13]以小鼠模型為研究對象，發現來源胚胎干細胞的微囊泡誘導FAK和JNK磷酸化，刺激滋養細胞遷移，促進胚胎植入。人蛻膜基質細胞來源的細胞外囊泡能夠介導SMAD2和SMAD2上調 N-鈣調蛋白的表達，促進滋養層侵入[63]。綜上，子宮內膜細胞或胚胎可以選擇性地將蛋白包裝到細胞外囊泡，然后運輸到相應的靶細胞引發靶細胞形態和功能上的改變，從而促進胚胎附植。研究還發現，外泌體中存在大量的金屬蛋白酶(如MMP-14、ADAM10等)[64]，而這些蛋白被報道廣泛參與ECM的重塑和細胞表面結合因子、受體及細胞因子的釋放[65-67]，能夠影響胚泡的形成率和著床率，誘導子宮內膜的容受性，促進胚胎附植[11]。

除了miRNA和蛋白質以外，外界刺激(光照、氧濃度)也會影響細胞外囊泡的釋放，調控胚胎附植。Bognar等[68]將不同光處理后的胚胎移植到假孕雌鼠子宮，第8.5天處死并檢測含核酸的細胞外囊泡數量和細胞凋亡情況，發現，細胞外囊泡數量和細胞凋亡數增加，對胚胎發育潛能無影響而植入能力下降。有研究者用不同氧氣處理體外牛子宮內膜間質細胞后，發現，低氧條件下外泌體含量增加，蛋白質組學分析發現，VNN1僅存在于富氧環境，它可以調節子宮的容受性，而ADAM10只在低氧條件下表達，參與細胞遷移和黏附[69]。

3 展 望

繁殖性能是影響畜牧產業發展的重要因素之一，胚胎附植作為哺乳動物妊娠過程的關鍵環節，探究胚胎附植的調控機制對提高畜牧產業效益顯得尤為重要。細胞外囊泡作為一種細胞間交流媒介，在介導細胞間通訊、參與免疫反應、當作藥物載體以及疾病標志物等方面越來越受科研工作者的青睞，最近研究表明，其在胚胎與母體的信息交流中發揮重要作用。目前，細胞外囊泡對胚胎附植的調控主要集中于其所包裹的miRNA和蛋白質靶向受體細胞，影響其生理功能和表型變化，但對在這一過程中離子通道的調控研究較少，進一步研究其在胚胎附植過程中的作用，有望揭開復雜的胚胎附植過程。