中國H9N2亞型禽流感病毒的流行現(xiàn)狀

孫華鵬，崔新鑫，潘亮奇，許豐祥，李 碩，吳梅花，朱旭輝，于亞南，李明亮，劉 楊，瞿孝云,廖 明,孫海亮

(人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室，嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510642)

1992年,H9N2禽流感病毒(AIV)在廣東地區(qū)首次暴發(fā)，隨后向其他地區(qū)蔓延[1]，1998年，迅速擴散到中國大部分省份[2]，已成為雞群中流行的禽流感病毒的主要亞型[3]。H9N2 AIV不但給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且跨宿主傳播感染哺乳動物和人，給公共衛(wèi)生安全構成嚴重威脅。1998年，從香港地區(qū)豬身上分離到H9N2 AIV，隨之陸續(xù)有豬感染H9N2 AIV的報道[4-7]。1998年，首次出現(xiàn)人感染H9N2 AIV的病例[8]，近年來不斷有人感染H9N2 AIV的報道[9-12]，血清學研究結果表明從事家禽行業(yè)的人群H9N2 AIV抗體率高達15%[13-15]。據(jù)WHO統(tǒng)計，2015年12月—2020年8月28日，中國已經(jīng)累計33人感染H9N2 AIV。另外，新型H7N9和H10N8 AIV的內部基因均來自H9N2 AIV[16-17]，導致人員感染并引起死亡，給公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅。因此，加強對H9N2 AIV的監(jiān)測，解析病毒致病性和跨宿主傳播能力的變化，對于流感病毒的綜合防控具有重要意義。

1 當前中國H9N2 AIV 的流行分布

為了解中國H9N2 AIV的流行分布情況，作者對NCBI上2016—2020年，3 014株 H9N2 AIV 的分離時間、地域和宿主進行了分析。結果顯示，2016—2020年，中國H9N2 AIV 分布在山東、廣東、安徽、廣西、湖南、湖北、福建、江西、云南、江蘇、浙江、重慶、黑龍江、山西、西藏、青海、寧夏、四川、北京、天津、上海、貴州等地。其中，H9N2 AIV分布較為密集地區(qū)為江西、廣東、貴州、江蘇，其次為云南、上海等(表1)。從病毒的分離來源來看，2016—2020年，中國流行的H9N2 AIV主要來自雞，少數(shù)來自鵪鶉、鴨、鵝，極少數(shù)分離自人。

表1 2016—2020年中國H9N2 禽流感病毒流行分布Table 1 Distribution of H9N2 avian influenza virus in China in 2016-2020

2 當前中國H9N2 AIV HA和NA遺傳演化分析

H9N2 AIV全球廣泛分布，主要分為北美、歐亞兩個分支，其中歐亞分支進一步分為BJ/94-like(或Y280-like)、G1-like、Y439-like、F/98-like等[18-19]。在中國，早期H9N2禽流感主要發(fā)生在香港和廣東地區(qū)，1995—2000年傳播到內陸地區(qū)[20]。參考HA進化分支方法[21]，中國H9N2 AIV主要分布在h9.4.2分支。2007年之前，中國主要流行h9.4.2.1-h9.4.2.4分支的H9N2 AIV，2007年之后，h9.4.2.5分支的H9N2 AIV逐漸成為主流，大約在2010年，h9.4.2.6分支的H9N2 AIV也擴展到全國各地，但是h9.4.2.5分支的H9N2 AIV比h9.4.2.6分支更加普遍[19]。先前H9N2 AIV NA分為BJ/94-like、G1-like和Korea-like 3個分支[22-23]。現(xiàn)在中國流行的H9N2 AIV NA演化為4個分支(Clade 0～3)，并且Clade 2分支的病毒在2010年后占據(jù)了主導地位[24]。

為了解中國當前流行的H9N2 AIV的遺傳演化情況，對NCBI上2016—2020年中國H9N2 AIV的HA、NA序列進行遺傳演化分析，HA系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，當前中國流行的H9N2 AIV絕大部分毒株隸屬于h9.4.2.5分支，極少部分毒株隸屬于h9.4.2.1分支，h9.4.2.6分支的病毒已經(jīng)不再流行 (圖1)。NA系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，當前中國流行的H9N2 AIV絕大部分毒株隸屬于BJ/94分支中的Clade 2亞分支(圖2)。綜上所述，當前中國流行的H9N2 AIV主要為h9.4.2.5分支的病毒。

圖1 2016—2020年中國H9N2 AIV HA遺傳演化Fig.1 Genetic evolution of H9N2 AIV HA in China from 2016 to 2020

圖2 2016—2020年中國H9N2 AIV NA遺傳演化Fig.2 Genetic evolution of H9N2 AIV NA in China from 2016 to 2020

3 H9N2禽流感病毒受體結合特性分析

當前H9N2禽流感病毒受體結合特性主要表現(xiàn)為雙嗜性和優(yōu)先結合α-2,6 SA受體，增強了病毒跨宿主傳播感染哺乳動物的能力。中國早期的H9N2 AIV優(yōu)先結合α-2,3 SA受體[25-26]，伴隨著病毒的持續(xù)流行，病毒的受體結合特性也發(fā)生了變化，近些年流行的H9N2 AIV表現(xiàn)出雙嗜性，并且結合α-2,6 SA受體的能力高于結合α-2,3 SA受體的能力，或者優(yōu)先結合α-2,6 SA受體的特性[26-32](表2)。

表2 H9N2 AIV受體嗜性演化情況Table 2 Phylogenetic evolution of H9N2 AIV receptor

HA蛋白的突變會改變病毒與受體的結合嗜性和結合強度。據(jù)報道，N313D、N496S、A180T/V、HA2-D46E突變增強病毒與α-2,6 SA和α-2,3 SA受體的能力[26,33-34]。220-loop缺失以及Q226L突變增強病毒與α-2,6 SA受體結合的能力[35-36]，而Q227P突變增強病毒與α-2,3 SA受體結合的能力。Q226L突變可以增強絕大多數(shù)H9N2 AIV 結合α-2,6 SA受體的能力，也有一些病毒雖然擁有226L，但是與α-2,6 SA受體的結合能力較差[37-38]。中國2016—2020年流行的H9N2 AIV中，99.5% (2 998/3 014)毒株的HA蛋白第226位為L，這表明當前中國流行的H9N2 AIV普遍增強與α-2,6 SA受體結合的能力，增加病毒跨宿主感染哺乳動物的風險。

4 當前H9N2禽流感病毒抗原性分析

H9N2 AIV持續(xù)暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失，為進一步防控H9N2 AIV，中國自1998年開始使用疫苗[39]。伴隨H9N2 AIV持續(xù)流行，病毒的抗原也發(fā)生了一定的變化。1998—2007年,全國分離的20株H9N2 AIV中，有18株病毒與A/CK/SD/6/96疫苗株的抗血清反應不佳(HI≤640)，有4株2007年的病毒與A/CK/SH/F/98疫苗株抗血清反應較差(HI≤80)[40]。2012—2013年，山東分離的6株H9N2 AIV 與A/CK/GD/SS/94疫苗株抗血清反應較差(HI≤320)，與它們本血清反應良好(HI≥1 280)[41]。2002年和2006—2014年，上海分離的14株H9N2 AIV，雖然起源于A/CK/SH/F/98，但是與其存在抗原距離[42]。對2011—2014年分離的28株H9N2 AIV和疫苗株SH/F/98和GD/SS/94進行分析，結果顯示，其中，4株病毒的抗血清與疫苗株H9N2 AIV及大多數(shù)分離株的反應較差[43]。對2013—2016年西南地區(qū)分離的12株H9N2 AIV與A/CK/GD/SS/94和A/CK/SD/6/96疫苗株進行分析，結果顯示，2014—2016年，分離毒株比2013年分離毒株與疫苗株的抗原性差異更顯著[44]，2017—2018年，山東地區(qū)分離的H9N2 AIV與A/CK/SH/F/98和A/CK/GD/SS/94疫苗株抗血清反應中等或者較差[45]。綜上所述，與早期病毒相比，近些年流行的H9N2 AIV已經(jīng)出現(xiàn)了抗原變異的現(xiàn)象。

HA蛋白是誘導產(chǎn)生中和抗體的主要抗原。H9N2 AIV HA蛋白的一些位點也陸續(xù)被揭示與抗原變異相關。Kaverin定義了兩個抗原位點，位點Ⅰ(147、165、170)，位點Ⅱ(145、197、206)，以及重疊位點(153、201、234)[46]。Wan等[47]揭示了兩個獨立的抗原位點“H9-1”(147、164、167、168)和 “H9-2”(153、196、200、201、207)。HA 蛋白218位糖基化位點缺失，同時，313位糖基化位點的出現(xiàn)增加了病毒與抗體的結合，中度阻止了病毒對同源抗血清中和作用的逃逸[48]。HA 蛋白N166D突變降低了病毒對雞的免疫原性[49]，而D200N突變提高了病毒與單克隆抗體的反應滴度[50]，N166D突變降低病毒雞的弱抗體反應。另外，92、90、166、133、138、141、143、149、157、180、230、234、252等位點也被證實與抗原相關[46,51-54](表3)。

表3 2016—2020年中國H9N2 AIV HA蛋白關鍵位點氨基酸的自然突變Table 3 Natural mutations of amino acids at key sites of H9N2 AIV HA protein in China from 2016 to 2020

為了解中國當前H9N2 AIV抗原變異情況，對NCBI上2016—2020年中國H9N2 AIV序列進行分析，結果顯示，在已經(jīng)報道的抗原位點中，除了165和170位點的氨基酸比較保守外[46,52]，其他位點的氨基酸都出現(xiàn)了多態(tài)性，其中，90、141、143、147、163、234、235位點的氨基酸呈現(xiàn)雙態(tài)性，剩余位點的氨基酸為3態(tài)及以上。218和313糖基化位點的缺失也改變病毒的抗原。綜上所述，當前中國H9N2 AIV的抗原正在發(fā)生著改變。

5 H9N2禽流感病毒的致病性

當前，H9N2 AIV持續(xù)在雞群暴發(fā),給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。H9N2為低致病性AIV，但近年來，致病性和跨宿主傳播能力呈現(xiàn)出增強的趨勢，出現(xiàn)了感染豬和人的案例，給公共衛(wèi)生安全帶來一定的挑戰(zhàn)。早期的H9N2 AIV毒株感染雞，主要在呼吸道復制，偶爾可以從泄殖腔拭子中檢測到病毒，只具有通過直接接觸方式在雞群中傳播的能力，1998年的毒株具備了通過氣溶膠在雞群中傳播的能力[55]。

2013—2015年的 H9N2 AIV，泄殖腔排毒的能力增強，通過泄殖腔的排毒量明顯高于通過口咽，感染雞群表現(xiàn)臨床癥狀，隨之出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。病毒除了在呼吸道復制以外，還可以在脾、肝、腎和腦中復制[31,56]。2017年的毒株可導致小家禽(鵪鶉)的喉頭、氣管、肺和心出現(xiàn)較為嚴重的病理損傷[57](表4)。

H9N2 AIV對哺乳動物的致病性也在發(fā)生變化。H9N2 AIV感染小鼠后，主要在肺進行復制，引起肺的病理變化，并引起小鼠體重的減輕，有些病毒還可以在鼻甲中進行復制[28,31,58-60]。H9N2 AIV感染豚鼠后，可以通過鼻腔向外排毒，但不具備通過直接接觸方式進行傳播的能力[26,31]。H9N2 AIV感染雪貂，主要在鼻甲、氣管和肺等呼吸道復制，有的病毒還可以在脾中復制[28](表4)。H9N2 AIV的某些蛋白發(fā)生突變，增強了病毒在哺乳動物細胞上的復制能力，增強病毒對哺乳動物的致病性。PB2蛋白E627K突變增強病毒對小鼠的致病性，Q591K突變增強病毒對小鼠的致病性，增強病毒在人氣管上皮細胞的復制能力，D195N、I292V、D253N突變增強病毒在人胚胎腎細胞(293T)或者人肺癌細胞(A549)上的復制能力[26,61-64]。PB1蛋白K577E突變增強病毒對小鼠的毒力以及在293T細胞上的聚合酶活性。PA蛋白K356R突變增強病毒對小鼠的致病性以及在A549和MDCK細胞上的復制能力[67]。HA蛋白N132D、N198S、T190V突變增強病毒對小鼠的毒力[27,61]。HA2蛋白D46E增強病毒的熱穩(wěn)定性，致使病毒具備了通過直接接觸方式在豚鼠間進行傳播的能力。HA1蛋白Q227P和NP蛋白E434K突變，增強了病毒在293T細胞上的聚合酶活性，促使病毒可以通過直接接觸方式在豚鼠間傳播[26](表5)。

表4 H9N2 AIV的致病性變化Table 4 Pathogenicity changes of H9N2 AIV

表5 突變對H9N2 AIV復制及致病性的影響Table 5 Effects of mutation on replication and pathogenicity of H9N2 AIV

作者對NCBI上2016—2020年中國H9N2 AIV序列進行分析，結果顯示，PB2蛋白第292位氨基酸為V的比例為87%(34/154)，第195位氨基酸為N和第627位氨基酸為K的比例均為1.3%(2/154)；PA蛋白第356位氨基酸為R的比例為94.2%(47/154)；HA蛋白第190位氨基酸為V的比例為2.8%(85/3 014)。這表明，當前中國流行的H9N2 AIV PB2、PA和HA蛋白獲得了一定的適應性突變，增強了在哺乳動物細胞上的復制能力，增強對小鼠的致病性，增加了跨宿主傳播甚至感染人的風險。

6 小結與展望

H9N2 AIVs不斷發(fā)生變異和重組，受體結合特性趨于雙嗜性或者優(yōu)先結合人類受體，致病性有增強的趨勢，抗原特性也在發(fā)生著改變，增加了跨宿主傳播甚者感染人的風險。目前，疫苗接種仍然是防控AIVs的主要手段。但是近年來出現(xiàn)了H9N2疫苗免疫后仍然排毒的情況，這使得H9N2 AIVs的防控變得更為棘手。一方面，可以通過遴選新抗原毒株、研制新型疫苗，開發(fā)新型佐劑等，提高H9N2疫苗的免疫效果。另一方面，應該強化生物安全防控理念，提高生物安全防控技術，采用生物安全防控手段控制疾病的發(fā)生。切實做好H9N2 等低致病性AIVs的防控，保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生的安全。