牛胚胎性別鑒定熒光定量PCR方法的優化與應用

馮春濤，顧文源，王志仙，趙增元,7，朱宏波，倪俊卿，褚素喬，余文莉*，李樹靜*

(1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050200；2.石家莊市畜牧技術推廣站，石家莊 050000；3.河北省動物疫病預防控制中心，石家莊 050035；4.河北省畜牧良種工作總站，石家莊 050020；5.河北省牛產業技術研究院，石家莊 050200；6.河北省奶牛良種繁育工程技術研究中心，石家莊 050200；7.河北省第三批“巨人計劃”創新創業團隊，石家莊 050200)

在畜牧業生產中，許多生產性狀受性別控制，后代性別預選為提高畜牧業系統的盈利能力和可持續性提供了機會[1]。奶牛作為重要的經濟動物，只有母?？梢援a奶，性別決定和性別控制對奶業生產具有重要意義[2]。在奶牛胚胎移植行業中，胚胎性別鑒定是一項強有力的工具，可以幫助奶牛養殖者更有效地管理其育種資源[3]。為了控制后代的性別，必須對植入前的胚胎進行有效的性別鑒定[4]。早期胚胎性別鑒定方法主要有細胞學方法、免疫學方法、分子生物學方法等[5]。20世紀80年代中期，牛Y染色體特異性DNA探針的鑒定，以及隨后聚合酶鏈式反應(PCR)技術的發展，使得胚胎的性別鑒定理論成為現實[6]。近幾年的研究表明，牛的雄性和雌性胚胎不僅在染色體補體上有差異，而且在轉錄活性和表觀遺傳狀態上也有差異。胚胎轉錄中的兩性異形影響碳水化合物和氨基酸代謝，雌性胚胎顯示較慢的線粒體代謝[7]，這提供了一條通過無創代謝組學進行胚胎性別標記測定的新思路。Hamilton等[8]用RT-PCR或RT-qPCR法性別鑒定的8個Y染色體關聯基因中的3個基因(DDX3Y-1、USP9Y-1、ZRSR2Y-1)代表了基于RNA胚胎性別鑒定的良好候選基因，并且可以代替基于DNA的性別鑒定步驟。

1990年，Herr等[9]首次用PCR方法對牛胚胎進行了性別鑒定，并且許多研究也證明了這項技術的潛力。Bredbacka等[10]報道,胚胎性別鑒定(從活檢到凝膠電泳結束)用6～7 h完成，而且有一些方法可以將性別鑒定所需的時間減少1～2 h。PCR方法因其靈敏高效、準確率高、所用時間短的特點而優于上述方法，被廣泛采用。但是PCR法存在容易被污染的危險，極易導致擴增出異源片段。

本研究利用牛折疊蛋白基因存在X染色體上的特點，設計1組引物及探針專用于鑒別牛的胚胎，然后再利用公牛的特異性基因SRY，選取其序列進行引物及探針的特異性設計，將兩組探針組合構建一個復合檢測體系，用于鑒定牛早期胚胎的性別，以有效地避免常規PCR所帶來的污染，提高檢出率及準確率，使檢測過程更加簡便，結果更加靈敏、可靠。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

用于生產胚胎的供體牛為12～15月齡的育種值排名前5%的荷斯坦育成牛，受體牛為低產奶?；蛭麟s黃牛。

1.2 試驗材料

1.2.1 胚胎 胚齡為7～7.5 d，發育階段為緊縮桑椹胚、早期囊胚、囊胚和擴張囊胚，質量為1、2級。

1.2.2 冷凍精液 世界排名前50名，與供體牛近交系數小于6.25%的荷斯坦種公牛凍精。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡(OLYMPUS)、胚胎分割儀(WETZLAR)、PCR儀、熒光定量PCR儀(7900HT)、熒光定量PCR儀(Q6)、電泳儀、UV顯像儀、POLAROID照相系統、胚胎冷凍儀(CL-5500,Australian)。

1.4 主要耗材與溶液

1.4.1 耗材 六孔平皿(PETS公司)、∮60 mm分割平皿(BECTON DICKINSON公司)、顯微分割刀(AB Technology,Inc,Pullman WA)、2 μL 取樣吸頭和200 μL通用吸頭(AB Technology,Inc,Pullman WA)、100 μL離心管、96孔板(Corning)。

1.4.2 溶液 PBS溶液(GIBOC)、胚胎保存液(HOLDING,ICP公司)、EG胚胎冷凍液(ICP公司)、YCD-PCR擴增反應試劑盒(美國AB公司)、雌性和雄性擴增對照樣品(美國AB公司)、胚胎分割液(SPLITTING，自制)。分割液配方：CaCl2·2H2O 0.05 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.04 g·L-1，KCl 0.2 g·L-1，KH2PO40.2 g·L-1，NaCl 8 g·L-1，Na2HPO41.15 g·L-1，EDTA.Na2·2H2O 0.001 5 g·L-1。

1.5 胚胎生產及胚胎取樣

1.5.1 胚胎生產 供體牛用CIDR-FSH-PG-GnRH 法超排，用常規非手術法采集胚胎。準備進行性別鑒定的胚胎在人工授精后第7天收集。根據IETS手冊，只采用從致密桑椹胚階段到擴張囊胚階段的1級 胚胎或在某些情況下的2級胚胎，在取樣前透明帶完好無損[6]，將胚胎洗滌10次。操作室溫度保持20～25 ℃，冷凍前胚胎保存在HOLDING液中。

1.5.2 胚胎取樣 將胚胎分割儀與倒置顯微鏡固定在一起，將顯微分割刀固定在顯微操作儀的操作手上，在∮60 mm培養皿中做一個50 μL的分割液滴，每個胚胎在取樣前先在分割液中洗5遍，將洗好的胚胎放入其中。胚胎被放大100倍進行分割取樣。在桑椹胚的邊緣或囊胚的滋養層切取細胞樣品。每個胚胎取樣后用移液槍吸取2 μL的回收液，從分割液滴中將樣品吸起，推入裝有8 μL超純水的100 μL EP離心管中。樣品取走后，用200 μL通用吸頭吸取50 μL HOLDING液，從分割液滴中將取樣后的胚胎吸起，放入六孔平皿對應的HOLDING液滴中準備移植或冷凍。

1.6 YCD-PCR法擴增目的基因片段

1.6.1 擴增體系及程序 YCD試劑盒含有PCR反應所需的特異性引物、內標物、dNTP、Taq酶等。在每個加有樣品的離心管中依次加入8.5 μL YCD，然后將其擺放在PCR反應槽中，變性溫度95 ℃，延伸溫度72 ℃，退火溫度64 ℃，經過30個循環65 min進行DNA擴增。PCR擴增結束后，吸取5 μL溴酚藍對樣品染色并點樣，啟動電泳儀。樣品在130～140 V電壓的瓊脂糖凝膠板上運行15～20 min。

1.6.2 電泳圖像判讀標準 如樣品出現3條電泳帶，即雌雄共有的常染色體基因片段、Y染色體上相應片段和“引物帶”的胚胎即雄性胚胎，只出現共有基因片段和“引物帶”的胚胎即雌性胚胎。判定結果分為3類：1)鑒定結果明顯：將雌或雄結果明顯，無任何污染條帶，定為性別鑒定有效。2)鑒定結果差:帶較暗；帶與帶之間模糊，外源DNA污染；雌性被雄性污染。3)無反應：只有引物帶或無帶。

1.7 熒光定量PCR方法擴增目的基因片段

1.7.1 引物及探針合成序列 利用牛折疊蛋白基因存在X染色體上的特點，設計1組引物NB2-F、NB2-R和探針NB2-P，然后再利用公牛的特異性基因SRY，選取其序列進行引物及探針的特異性設計，設計引物BOV97M-F、BOV97M-R和探針BOV97M-P，將兩組探針組合構建一個復合性別鑒定體系，見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescent quantitative PCR

1.7.2 熒光定量PCR方法不同的擴增體系 單引物分別擴增體系(熒光單擴)：將胚胎樣品DNA分成兩份，分別利用內標引物和雄性位點引物進行擴增，根據內標和性別位點各自擴增結果合成胚胎性別判定結果；熒光雙引物混合擴增體系(熒光雙擴)：將胚胎樣品DNA與內標引物和雄性位點引物混合液同時擴增，根據內標和性別位點擴增情況判定胚胎性別。

1.7.3 熒光定量PCR擴增體系和程序 反應體系:Probe FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal 5 μL，引物探針混合液(1∶3)Primer and probe mixture 1.2 μL，DNA 6 μL，探針ROX校正染料* Probe ROX calibration dye 0.2 μL，超純水補至15 μL。反應程序設定：95 ℃預變性3 min；然后95 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，共45個循環；72 ℃10 min延伸后結束。

1.7.4 數據分析和結果判讀標準 根據表2中的判讀標準，依據內標的擴增曲線和CT值及性別位點的擴增曲線和CT值判讀胚胎樣本的性別。雌或雄結果明確者為鑒定有效。

表2 熒光定量PCR結果判讀標準Table 2 Standard for interpretation of fluorescence quantitative PCR results

1.8 胚胎冷凍及解凍

1.8.1 胚胎冷凍 取樣后胚胎在乙二醇(EG)冷凍液中平衡5 min并裝入0.25 mL細管后，放于冷凍儀上進行常規冷凍。冷凍程序：-6 ℃平衡5 min，植冰平衡5 min，按0.5 ℃·min-1降溫至-35 ℃投入液氮。

1.8.2 胚胎解凍 將雌性胚胎從液氮中取出，直接放入32～35 ℃水浴中10 s，將細管外的水跡拭干，將胚胎直接推入HOLDING液中洗3～4次，采用四段式將胚胎吸入0.25 mL細管內移植。

1.9 受體牛同期發情和移植

用CIDR-PG技術對受體牛進行同期發情處理，選用發情后6.5～8.5 d、黃體合格的受體牛進行移植。胚胎移植后60 d采用直腸檢查法對受體牛進行妊娠檢查。

1.10 統計分析

采用SPSS 20軟件進行χ2檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1 不同方法的胚胎性別鑒定效果分析

本試驗以進口YCD試劑盒PCR鑒定方法為對照組，熒光定量PCR的單引物分別擴增方法(熒光單擴，single primer separate amplification，FSPSA)和雙引物混合擴增方法(熒光雙擴，double primer mixed amplification，FDPMA)分別為試驗組，對各組間的性別鑒定效率(efficiency of sex identification)、無反應率(non-reaction rate)、雌雄胚胎百分率(percent of female and male embryos)和比值(ratio of female and male embryos) 進行比較。

如表3所示：1) 熒光單擴組的雌性胚胎百分率極顯著高于其他兩組(P<0.01)，而PCR電泳組和熒光雙擴組之間差異不顯著。2) 熒光單擴組的雄性胚胎百分率極顯著低于熒光雙擴組(P<0.01)，極顯著高于PCR電泳組(P<0.01)，而PCR電泳組和熒光雙擴組之間差異不顯著。3) PCR電泳組、熒光單擴組和熒光雙擴組胚胎的雌雄比分別為1∶1.02、1.03∶1和1∶1.03。4) 熒光單擴組的鑒定結果差胚胎的百分率極顯著低于其他兩組(P<0.01)，而熒光雙擴組和PCR電泳組之間差異不顯著。5) 3組間的性別鑒定無反應率差異極顯著，PCR電泳組最高，熒光單擴組最低(P<0.01)。6) 3組間的性別鑒定效率差異極顯著，熒光單擴組最高，PCR電泳組最低(P<0.01)。

表3 不同方法的胚胎性別鑒定效果差異性分析Table 3 Analysis on the difference of embryo sex identification results by different methods

2.2 不同鑒定方法對雌性胚胎準確性的影響

本試驗以進口YCD試劑盒PCR鑒定方法為對照組，熒光單擴和熒光雙擴分別做試驗組，對各組間的雌性胚胎母犢率(female calf rate of female embryos,FCRFE)進行比較。

如表4所示，通過對3種方法產母犢準確率的比較，熒光單擴組的產母犢準確率極顯著低于熒光雙擴組和對照組(P<0.01)，熒光雙擴組和對照組之間差異不顯著(P>0.05)。綜合表3、表4分析可知，熒光雙擴方法是一種優于PCR電泳和熒光單擴的早期胚胎性別鑒定方法。

表4 不同方法之間雌性胚胎性別鑒定準確性比較Table 4 Comparison of sex identification accuracy for female embryos among different methods

2.3 取樣細胞數量對熒光雙擴方法性別鑒定效果的影響

為進一步優化熒光雙擴鑒定方案，對不同胚胎取樣數量的性別鑒定效果進行分析。如表5所示：1)SD組的雌性胚胎百分率顯著高于4～6組(P<0.05)，其他3組之間差異不顯著。2)SD組的雄性胚胎百分率極顯著低于4～6和7～10組(P<0.01)，與1～3細胞組差異不顯著；4～6組極顯著高于1～3組(P<0.01)，與7～10組之間差異不顯著。3)1～3組、4～6組、7～10組和SD組胚胎的雌雄比為1.03∶ 1、1∶1.08、1∶1.08和1.09∶1。4)1～3組和SD組的鑒定結果差率極顯著高于4～6組 和7～10組 (P<0.01)，而1～3組和SD組之間及4～6組和7～10組之間差異不顯著。5)SD組的性別鑒定無反應率極顯著高于4～6組和7～10組(P<0.01)，與1～3組差異不顯著；1～3組顯著高于7～10組(P<0.05)，4～6組和7～10組之間差異不顯著。6)4～6組 和7～10組的性別鑒定效率極顯著高于1～3組和SD組(P<0.01)，而1～3組和SD組之間及4～6組 和7～10組之間差異不顯著。7)擴增CT值為擴增的循環次數，由試驗結果可知，隨胚胎細胞取樣數增加CT值下降，組間差異極顯著(P<0.01)；SD組極顯著高于4～6組和7～10組(P<0.01)，而極顯著低于1～3組(P<0.01)。

表5 取樣細胞數量對熒光雙擴方法性別鑒定效果的分析Table 5 Analysis of the effect of the number of cells sampled on the detection of fluorescence multiplex method

2.4 取樣細胞數量對胚胎移植妊娠率的影響

為分析取樣操作對胚胎移植妊娠率(pregnancy rate of embryo transfer,P/ET)的影響，對分割取樣前質量為1級的胚胎進行統計分析。如表6所示，隨取樣細胞數增加，妊娠率有下降趨勢，但統計無顯著差異(P>0.05)，綜合分析表5、表6可知，雖然取樣1～3個細胞也能獲知胚胎性別，但綜合考慮性別鑒定效率和移植妊娠率，最佳取樣細胞數量為4～6個。

表6 不同取樣細胞數量對胚胎移植妊娠率的影響Table 6 The influence of the number of sampled cells on the pregnant rate of embryo transfer

2.5 試驗成本分析比較

為了更加精確地核算胚胎鑒定成本，如表7所示，以鑒定200枚胚胎為例，將PCR電泳法和熒光定量PCR法鑒定成本進行計算，進而分別算出單枚胚胎鑒定費用，結果表明，熒光定量PCR法比PCR電泳法成本降低了46.76%。

表7 不同性別鑒定方法成本比較(以每批鑒定200枚計算)Table 7 Comparison of the cost using different sex identification methods (at 200 embryos per batch)

3 討 論

畜牧業的發展促進了性別控制方法在實踐中的應用，以提高經濟效益，加快動物的育種進程。性控技術結合超數排卵和胚胎移植技術用于奶牛生產中具有重大的實踐意義[11]。性別控制可以通過精子分離或早期胚胎性別鑒別來實現[12]。目前，性別分離后的精液每支細管約有90%的X-精子[13]，集中用于牛的人工授精和體外受精(IVF)程序，當用于FSH超排處理的供體母牛其體內胚胎生產量低于常規精液[14]，用于牛胚胎體外生產其受精卵卵裂率、囊胚發育率以及移植妊娠率顯著低于常規精液，從而限制了該技術的進一步推廣[15-16]。相反，用PCR法進行胚胎性別鑒定能克服用性控精液生產體內或體外胚胎的一些局限性，是一個可供選擇的方法[14]。

PCR方法之所以在牛胚胎性別鑒定中較常用是基于特別序列的擴增，其操作簡便，用時較短，但PCR擴增結果受很多因素的影響，需要較多的胚胎細胞才能得到準確的鑒定結果，特別是在胚胎性別鑒定取樣細胞數較少的情況下，有時在紫外透射分析儀下根本看不到擴增產物的電泳帶[17]。污染也可能來自于由分解DNA的裂解細菌產生的核酸酶。但是，在適當的條件下操作樣品，并在每次分析之間仔細沖洗，可以很容易避免這種情況[7]。

1990 年，Sinclair等[18]發現，決定雄性的是Y染色體短臂上的一個微小片段，稱為Y染色體性別決定基因—SRY基因，是啟動睪丸形成的主基因，即SRY基因是哺乳動物性別決定的開關。如果沒有SRY基因的存在，性腺原基發育為卵巢；如果有SRY基因存在，性腺原基則發育為睪丸[19]。研究表明，SOX9基因在哺乳動物生殖活動中發揮著重要的調控作用，與性別分化、精子發生等生殖活動密切相關[20]。此外，DMRT1[21]、SOX9[22-23]、SF1[24]、WT1[25]、LIM1[26]、LHX9[27]、Gadd45G[28]和FOXL2[29]等基因對動物性別的決定和性器官的分化起著重要作用。1995年，Daneau等[30]報道了牛SRY基因的序列，對牛的SRY基因序列進行分析表明，牛SRY基因無內含子，其間是一個可讀框(ORF)，由687個堿基組成，編碼229個氨基酸，啟動子序列含有特異的CAAT-box和TATA-box結構。各種哺乳動物的Y染色體上均存在SRY基因，它們具有較高的同源性和高度的保守性[31]。因此，SRY基因可以作為性別鑒定的主要目標基因[32]。

本研究以SRY基因作為性別鑒定目標基因，以進口YCD-PCR試劑盒的性別鑒定結果作為對照組，以熒光雙擴和熒光單擴作為試驗組，通過對性別鑒定效率、無反應率、雌雄胚胎比、雌性胚胎產犢準確率等指標的綜合比較，結果表明，熒光雙擴組的雌性胚胎率、雄性胚胎率和雌性胚胎產母犢率均與對照組無顯著差異，無反應率極顯著低于對照組，而性別鑒定效率極顯著高于對照組，其雌雄胚胎比也與對照組相似(1∶1.03和1∶1.02)，更接近常規凍精人工授精的母犢公犢比(1∶1.05)[33]。盡管熒光單擴組的雌性胚胎百分率和性別鑒定效率極顯著高于其他兩組，雄性胚胎率、無反應率極顯著低于其他兩組，但其雌雄胚胎比值與常規凍精人工授精有較大偏差(1.03∶1vs1∶1.05)[34]，產母犢準確率極顯著低于熒光雙擴組和對照組。以上分析表明，熒光雙擴方法是一種更可行的牛胚胎性別鑒定技術。

PCR技術需要對植入前胚胎的卵裂球活檢以進行性別鑒定[5]。從牛胚胎中取出一個或多個細胞是用DNA擴增法進行胚胎性別鑒定所必需的?；顧z會降低胚胎存活率和胚胎移植妊娠率[33]。但是也有文獻表明，只要不斷加強技術人員的操作水平，就不會對胚胎存活率造成明顯影響[35]。

盡管在20世紀80年代后期的第一次研究涉及8～10個細胞，現在大多數用于性別鑒定的樣本有4～5個 細胞，足以達到理想的靈敏度[6]。Park等[4]用8、4、2、1個卵裂球進行連續多重PCR胚胎性別鑒定的效率分別為100.0%、96.3%、94.3%和92.1%。Tavares等[14]從1 847個胚胎的活檢中獲得了95.9%的平均胚胎有效性別確定率，與其他關于家畜胚胎性別鑒定的研究一致。本研究用7～10、4～6、1～3個卵裂球進行熒光雙擴PCR胚胎性別鑒定的鑒定效率分別達到96.93%、96.56%、93.78%，與以上研究一致。

PCR法對于應用是有效的，即使活檢胚胎經過冷凍保存，其妊娠率也與非活檢的胚胎相當[14]。胚胎移植行業最常采用的方法是用乙二醇冷凍牛胚胎，解凍后直接移植[36]。Thibier和Nibart[6]在其移植的833例性別鑒定冷凍胚胎中，60～90 d孕檢的移植妊娠率為45.3%。Shea[3]報道，性別鑒定鮮胚的妊娠率(58%～71%)與常規鮮胚相當，而冷凍/解凍后的性別鑒定胚胎妊娠率較低(37%～66%)，但足以商業化應用。本研究對5 849枚取樣后胚胎進行程序化冷凍，解凍后移植，60 d孕檢，取樣4～6細胞的胚胎移植妊娠率為49.68%，平均移植妊娠率為48.74%，達到商業化應用水平。

一些研究所用的牛Y染色體特異性DNA探針鑒定成本為13美元[6]，Tavares等[14]在2015年用PCR和電泳方法平均成本接近每樣本2美元。本研究用進口YCD-PCR試劑盒鑒定1枚胚胎成本約為14.64美元，而熒光雙擴方法鑒定成本為7.79美元，鑒定成本降低了46.76%，更加有利于性別鑒定胚胎的推廣應用。

4 結 論

本研究建立了一種新型的牛早期胚胎性別鑒定方法，其熒光雙引物混合擴增方法產母犢準確率高，鑒定成本低，取樣4～6細胞的胚胎移植妊娠率最高，適于商業化應用，是一種更可行的牛胚胎性別鑒定技術，更有利于產業化推廣和應用。