不同飼喂水平對綿羊睪丸發育、睪酮合成相關基因及雄激素受體(AR)表達的影響

石 磊，牛宏澤，姚曉磊，宋瑞高，呂麗華，張春香，張建新，任有蛇

(山西農業大學動物科學學院，太谷 030801)

動物的生長發育和正常代謝機能的維持都與飼料營養水平有密切的聯系[1-2]。生殖機能同其他機體生理功能一樣，都需要多種營養物質維持，機體通過為配子發生、受精、胚胎發育、妊娠等活動提供特定的營養元素來直接或間接調控動物的生殖機能[3-5]。研究表明，短期限飼不僅可以影響血液中氨基酸、葡萄糖含量和代謝相關酶類的水平，還能通過調控雌激素和睪酮水平抑制卵泡發生[4]。日糧營養水平能通過調控卵泡中促卵泡素受體(follicle stimu-lating hormone receptor，FSHR)和黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)的表達來影響卵泡的發育[6]。生產中也經常發現，體況差的雌性動物通常表現出不發情、不排卵和受胎率降低等一系列繁殖障礙。對于雄性動物，旺盛的性欲和良好的精液品質是保障母畜受胎率的關鍵，日糧營養就顯得尤為重要。研究發現，營養水平可以影響動物睪丸的發育和精子發生，營養低下會降低公畜睪丸重量和精子細胞的數量，從而導致精子活力差、密度低和睪酮水平下降[7-8]。這說明營養水平不但能通過調控代謝機能影響動物的體況，還能通過下丘腦-垂體-性腺軸的相應受體作用于生殖系統，進而影響動物的生殖機能。

雄性動物生殖系統發育和正常生精機能的維持主要依靠雄激素，雄激素以睪丸間質細胞分泌的睪酮(testosterone，T)為主。睪酮是以膽固醇為原料，在類固醇合成急性調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)的調控下經細胞色素P450家族成員11A1(cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，CYP11A1)裂解其側鏈成為孕烯醇酮，然后由3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)轉化為孕酮，孕酮在內質網由細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 steroid 17-α-monooxygenase，CYP17A1)催化轉變為脫氫表雄酮后代謝為睪酮[9]。與靶細胞內雄激素受體(androgen receptor，AR)的特異性結合是睪酮發揮其生物學效應的關鍵[10-11]。研究者對AR的結構、功能和定位進行了大量研究，但目前，AR在不同種類雄性動物生殖器官中的表達部位仍然存在較大爭議[12-14]。與其他固醇類激素受體類似，AR是一種具有配體活性的轉錄因子，一旦被雄激素激活便能識別靶基因上的雄激素反應元件(androgen response element，ARE)并與之結合，ARE主要位于目的基因附近，通過結合目的基因的啟動子或沉默子來增強或抑制靶基因轉錄，最終使細胞的功能發生改變[15]。目前，關于營養對動物繁殖性能影響的研究主要側重于母畜發情[16-17]、胚胎發育[18]及初生仔畜成活率[19]等方面，對雄性動物繁殖性能的影響主要集中在精液品質方面[20-22]，關于睪酮合成及其作用機理等方面的研究相對較少。

本試驗以杜泊羊(♂)×晉中綿羊(♀)雜交F1代公羔為研究對象，通過采食量調控羔羊營養水平，研究不同飼喂水平對綿羊睪丸發育、T水平及T合成相關基因及AR表達的影響，同時對AR在綿羊睪丸組織中的定位進行了研究，以期為通過營養水平調控綿羊繁殖性能，充分發揮其生殖潛力提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與試驗動物

本研究采用單因素完全隨機設計，將18只體況良好和體重相近((35±0.5) kg)的杜泊羊(♂)×晉中綿羊(♀)F1代雜交4月齡公羔隨機分為3組，每組6只。以平均日增重為目標，根據綿羊采食量的標準，分別按自由采食(AL組)、自由采食量的65%(AL65組)和自由采食量的40%(AL40組)3個飼喂水平投喂全混合顆粒飼料。AL40組為維持采食量組，其平均日增重為0 g·d-1，AL65組日增重維持在150 g·d-1，AL組日增重維持在300 g·d-1。當AL組任意1只綿羊的體重達到50 kg時全部進行屠宰。

1.2 主要試劑

Trizol、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；Rabbit Anti-AR 和Rabbit Anti-β-actin多克隆一抗、HRP標記的Goat Aniti-Rabbit二抗，DAB、即用型SABC免疫組化試劑盒等均購自武漢博士徳公司；BSA、NC膜、SDS-PAGE制膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Marker等均購自索萊寶公司；綿羊睪酮ELISA試劑盒購于上海藍基生物公司；其他常用試劑為國產分析純。

1.3 試驗日糧

本研究的試驗日糧配方參考NRC(2007)綿羊營養需要量配制全混合顆粒飼料。試驗日糧的組成及營養水平見表1。

表1 試驗日糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) %

1.4 羔羊飼養管理

試驗羊只采用全舍飼單欄飼養，預飼期10 d，正飼期55 d。預飼前打耳號、驅蟲、免疫，使其適應試驗日糧，進入正飼期后，嚴格按照配方要求提供顆粒飼料。掌握其采食情況，并適當調整體重，使其盡可能一致。根據預飼期的采食量確定AL組日飼喂量。每日記錄個體采食量，并在晨飼前清除飼槽內剩料，記錄剩料量，保證自由采食組剩料量約為飼喂量的10%，并根據AL組的采食量確定AL65組和AL40組的日飼喂量。每日于08:00和18:00兩次飼喂，自由飲水，圈舍溫度維持在合理的范圍內。當AL組中任意1只綿羊體重達到50 kg時，飼喂試驗結束。

1.5 睪丸樣品采集

飼喂試驗結束后，手術法摘取綿羊睪丸，分別測定睪丸的周徑與長度；采集的睪丸組織分為兩部分：一部分切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織塊，4%多聚甲醛固定；另一部分用錫紙包好后放入凍存管，立即投入液氮保存，帶回實驗室后放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.6 試驗方法

1.6.1 睪丸組織切片觀察 常規方法制作睪丸組織的石蠟切片，經過H-E染色后在顯微鏡(Olympus BX53，Japan)下觀察，每個切片隨機選取5個不同的視野，使用Image-Pro Plus 7.0軟件測定曲精細管直徑、生精上皮厚度和生精細胞與間質細胞密度。

1.6.2 實時定量PCR檢測基因表達情況 使用Trizol法提取綿羊睪丸組織的總RNA，用核酸蛋白測定儀(ND-1000，NanoDrop)進行質檢后反轉錄合成cDNA。根據NCBI提供的綿羊睪酮合成基因(STAR、3β-HSD、CYP11A1和CYP17A1)、AR和18S的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表2)，由上海生工生物工程公司合成。擴增操作按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒建議的反應條件，構建反應體系，總體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.4 μL，每個樣本3次重復。

表2 熒光定量PCR的引物Table 2 Primer sequences used for qRT-PCR in this study

1.6.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定睪酮(T)水平 將不同處理的睪丸組織進行勻漿，嚴格按照試劑盒操作說明進行。通過測定6個濃度標準品的濃度值和對應的OD值，使用四參數Logistics曲線擬合法，橫坐標為T濃度，縱坐標為OD值，擬合出標準曲線。使用此標準曲線的方程，結合各待測樣品的OD值，計算出各個樣品的T濃度。

1.6.4 蛋白免疫印跡法分析雄激素受體(AR)豐度 提取綿羊睪丸組織的總蛋白并測定蛋白濃度，然后進行Western blotting 檢測。蛋白上樣量為60 μg，SDS-PAGE電泳采用5%濃縮膠80 V 30 min，10%分離膠120 V 1.5 h，轉膜條件為100 V 1.5 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育Rabbit Anti-AR(1∶200)和Rabbit Anti-β-actin(1∶400)多克隆一抗，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min，Goat Anti-Rabbit(1∶1 000) 二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL曝光后觀察并拍照。

1.6.5 雄激素受體(AR)的免疫組織化學定位分析 取睪丸組織切片，常規方法脫蠟至水，滴加3% H2O2，37 ℃ 10 min；PBS沖洗3次，各3 min；檸檬酸緩沖液98 ℃抗原修復，待冷卻至室溫；5%BSA室溫封閉 30 min；滴加Rabbit Anti-AR一抗(1∶200)4 ℃過夜后PBS洗3次，加HRP標記二抗37 ℃ 30 min；同時設置陰性對照，一抗用PBS代替。Olympus生物顯微鏡(BX53)觀察，并使用Image-Pro plus 7.0軟件拍照。

1.7 數據處理

qRT-PCR數據使用2-△△CT方法計算相對表達量。用Image J軟件對免疫印跡條帶的灰度值進行分析。數據結果采用SPSS統計軟件使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan’s法進行多重比較，結果表示為“平均值±標準誤(SEM)”。

2 結 果

2.1 不同飼喂水平對綿羊睪丸發育的影響

不同飼喂水平對綿羊睪丸發育的分析結果如表3所示，綿羊睪丸的周徑與長度隨著飼喂水平的提高而升高，其中，AL組顯著(P<0.05)高于AL40組，但與AL65組間差異不顯著(P>0.05)。對綿羊睪丸組織結構的觀察發現(圖1)，AL組睪丸曲精細管生精上皮厚度顯著高于限飼組(P<0.05)，但AL40和AL65組間差異不顯著(P>0.05)，不同營養水平對綿羊睪丸曲精細管直徑無明顯影響(P>0.05)。曲精細管中均可觀察到各級生精細胞和間質細胞，隨著飼喂水平的提高，生精細胞和間質細胞的密度顯著增加(P<0.05)。

表3 不同飼喂水平條件下綿羊睪丸發育的形態學和組織學參數Table 3 Testicular morphological and histological parameters of sheep under different feeding levels

A.AL40組；B.AL65組；C.AL組A.AL40 group;B.AL65 group;C.AL group圖1 不同飼喂水平條件下綿羊睪丸組織H-E染色結果(400×)Fig.1 H-E staining results of testis in sheep under different feeding levels(400×)

2.2 不同飼喂水平對綿羊睪丸睪酮分泌和睪酮合成相關基因表達的影響

如圖2所示，AL40組綿羊睪丸組織中T水平最低，隨著飼喂水平的提高，睪丸組織中的T水平顯著提高(P<0.05)。通過對睪丸組織T合成相關基因表達的分析(圖3)發現，AL組中STAR和3β-HSD基因的相對表達量均顯著高于限飼組(P<0.05)，其表達情況與睪丸組織T水平的變化一致。AL組中CYP17A1和CYP11A1基因也均呈現高表達，且顯著高于AL40組(P<0.05)；AL65和AL40組間CYP17DA1和CYP11A1基因的表達量差異不顯著(P>0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同Different letters mean significant difference (P<0.05),same letter means no significant difference (P>0.05),the same as below圖2 不同飼喂水平綿羊睪丸組織中的睪酮含量Fig.2 Testosterone content in testis of sheep under different feeding levels

圖3 不同飼喂水平下睪酮合成相關基因在綿羊睪丸中的相對表達量Fig.3 Relative expression level of T synthesis-related genes in the testis of sheep under different feeding levels

2.3 不同飼喂水平對綿羊睪丸組織AR mRNA和蛋白表達的影響

由圖4可知，AL40組睪丸組織中ARmRNA的相對表達量(圖4A)最低，隨著飼喂水平的提高而顯著提高(P<0.05)。AR蛋白豐度(圖4B)與mRNA的表達情況基本一致，即AL組>AL65組>AL40組。

圖4 不同飼喂水平下AR mRNA和蛋白在綿羊睪丸中表達量Fig.4 The expression of AR mRNA and protein in the testis of sheep under different feeding levels

2.4 綿羊睪丸中AR蛋白的定位

AR蛋白在綿羊睪丸組織中定位的結果如圖5所示，曲精細管中部分精原細胞、初級精母細胞和精子細胞可以檢測到陽性信號，睪丸間質細胞、管壁肌樣細胞和血管平滑肌細胞均可檢測到AR陽性信號。

A.間質細胞和曲精細管的生精細胞；B.間隙中的血管和曲精細管的生精上皮。Sg.精原細胞；PS.初級精母細胞；St.精子細胞；LC.間質細胞；PMC.曲精細管管周肌樣細胞；BV.間質血管平滑肌細胞A.Leydig cells and spermatogenic cells;B.Interstitial blood vessel and the germinal epithelium of seminiferous tubule.Sg.Spermatogonia;PS.Primary spermatocytes;St.Spermatid;LC.Leydig cells;PMC.Peritubular myoid cells;BV.Smooth muscle cells of interstitial blood vessel圖5 AR在綿羊睪丸組織中的免疫組化定位 (400×)Fig.5 Localization of AR in testis of sheep using immunohistochemistry (400×)

3 討 論

生殖器官指數能夠在一定程度上反映動物機體的生殖機能狀況[23]。本試驗首先檢測了不同飼喂水平下羔羊睪丸的整體發育情況，發現AL組綿羊睪丸的周徑與長度顯著高于AL40組。由于所用試驗動物初始體況基本一致，綿羊睪丸的周徑和長度出現的差異應是由于不同營養水平導致的，這說明飼喂水平對羔羊睪丸的生長發育有一定的影響。Pang等[24]的研究也發現，30%的能量限制對綿羊睪丸的發育有明顯影響，造成了睪丸重量和生精細胞數量下降。然而，在本研究中，AL65組和AL組綿羊睪丸的周徑與長度差異不顯著，這說明日糧飼喂水平在基本滿足動物機體基本營養需要的情況下，繼續提高營養水平并不能顯著促進綿羊睪丸的生長發育，這與前人在綿羊上的研究結果基本一致[23-26]。此外，從睪丸組織形態學分析的結果可以看出，隨著營養水平的降低，曲精細管生精上皮厚度明顯下降，生精細胞的數量也逐漸減少，再次說明不同飼喂水平能影響動物睪丸的發育。然而，本試驗中不同處理組間綿羊睪丸曲精細管的直徑差異并不顯著。Glass等[27]的研究發現，低蛋白日糧可造成大鼠睪丸和前列腺的重量下降，但曲精細管直徑未發生明顯改變。課題組前期在山羊上的研究也觀察到，睪丸曲精細管的直徑未受到日糧中添加微量元素的影響[28]。這說明曲精細管的直徑可能與該物種本身有關。

在動物生殖器官的發育過程中，生殖激素起著最重要的作用。本研究發現，隨著飼喂水平的提高，T的分泌量也逐漸增加。這說明飼喂水平能夠影響生殖激素的分泌。李碧波等[8]發現，日糧營養水平對山羊血清中的睪酮含量影響極顯著，提高能量水平能提高動物的射精量、精子密度和有效精子數。在綿羊上的研究還發現，提高能量水平可通過提高公羊促性腺激素LH和FSH的合成與釋放促進睪酮的分泌，從而提高動物的精液品質和繁殖性能[29]。動物的睪酮主要是由睪丸的間質細胞合成和分泌，本研究中睪丸組織T水平的變化與間質細胞密度的分析結果一致，提示，日糧營養水平可以通過改變生殖內分泌來影響睪丸發育，而這可能與營養水平調控間質細胞的增殖有關，但也不能排除營養水平可以影響睪酮合成的可能性，因此，其確切機理還有待進一步研究。為此，本試驗通過qRT-PCR方法對睪酮合成相關基因STAR、3β-HSD、CYP11A1和CYP17A1的表達量進行分析，發現AL組的高營養水平顯著增強了這些基因的表達。這說明營養水平可以影響間質細胞中睪酮合成基因的表達，從而提高睪丸組織中的睪酮水平。這些結果表明，營養水平對于雄性生殖機能的調控是多方面的，營養物質在促進間質細胞增殖的同時，還促進睪酮合成基因的表達。這也從另外一方面體現了營養物質對動物機體發育和生理功能調控的復雜性。

雄激素與靶細胞上對應的雄激素受體特異性結合才能發揮其生物學效應[10-11]。馬瑞等[30]通過在大鼠血管平滑肌細胞中添加不同濃度的T，發現一定濃度的T能夠促進細胞的增殖，同時AR表達水平也得到了上調。最近，在山羊睪丸上皮細胞和小鼠支持細胞上的研究也發現，T能顯著增強細胞中AR的表達[31-33]。提示，睪丸中T作用的發揮與AR的表達水平有著必然的聯系。研究發現，T不僅可以影響AR的表達，還能通過結合AR激活下游信號通路中精子發生關鍵信號分子的表達，從而調控動物的生精機能[33]。可以推測，營養水平不同造成睪丸中T的差異勢必會引起AR表達水平的變化，這樣才能充分發揮睪酮的生殖調控功能。因此，本試驗采用qRT-PCR和Western blotting的方法研究了AR mRNA和蛋白的表達情況,結果發現，AR蛋白表達規律與mRNA豐度趨勢基本一致，隨著飼喂水平的提高，其表達量也相應的提高。這說明，飼喂水平可能通過改變睪丸AR的表達，發揮T對睪丸生精上皮發育和精子發生過程的調節作用，從而影響動物的生殖機能。Genovese等[34]在大鼠上的研究發現，限飼能顯著降低睪丸中AR的表達。另外，在卵巢上的研究也表明，飼喂水平通過改變LHR和FSHR的表達量促進FSH和LH對卵泡的發育調節作用[4,6,35]。這充分說明，飼喂水平能夠調節生殖激素相關受體表達水平，從而影響動物配子發生與生殖器官發育。

目前，AR在不同種類雄性生殖器官中的表達部位仍然存在爭議。本研究同時采用免疫組化的方法對綿羊睪丸中AR進行了定位分析，結果發現，AR在精原細胞、初級精母細胞、精子細胞、管周肌樣細胞、血管平滑肌細胞和間質細胞均有表達。這與李振等[36]的研究結果一致。Ge等[37]的研究發現，AR在綿羊睪丸中呈現高表達，主要在附睪上皮、基膜、平滑肌、間質細胞和精子中檢測到了AR陽性產物。在山羊上的研究也發現，AR在間質細胞中呈現高密度強陽性表達，在各級生精細胞中呈現中等強度的陽性表達[38]。這說明，AR對雄性動物生殖機能發育和精子發生具有重要作用。然而，通過對曲精細管生精上皮不同生精細胞的觀察發現，有些生精細胞不表達AR或呈現弱陽性表達，這說明AR在生精細胞中的表達有一定階段性，可能與精子發生過程中生精細胞所處的時期有關，生精細胞可能只有在增殖和分化的特定時期才會受到雄激素的調控，AR也在這一階段豐度增加來結合雄激素，從而調控生精細胞的生理活動。當其沒有表達AR或AR豐度太低時，說明這些細胞對T的敏感性較差，不具備增殖或向下一級生精細胞分化的條件，其中部分生精細胞可能會凋亡。AR在間質細胞表達，說明T對間質細胞的功能可能存在自反饋調節，AR在間質細胞中的表達對于確保間質細胞的增殖和T分泌功能是非常必要的[39-41]。AR的表達在曲精細管管壁肌樣細胞和血管平滑肌細胞中并沒有表現出階段性，這些部位是血睪屏障的重要組成部分，AR的持續高水平表達可能與T的轉運和釋放有關。

此外，T的合成與分泌受下丘腦-垂體-睪丸軸調控，其中經典的分子信號通路是黃體生成素(LH)-黃體生成素受體(LHR)-環磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)途徑。因此，營養水平是如何通過影響T合成與分泌以及AR的表達來調控睪丸發育和精子的發生過程，仍然需要進一步研究。

4 結 論

較低的飼喂水平抑制了綿羊睪丸發育，降低了曲精細管生精上皮厚度、生精細胞和間質細胞密度。T合成相關基因和AR的表達量隨飼喂水平的提高而增加，且與睪酮的變化趨勢一致。AR在綿羊睪丸精原細胞、初級精母細胞、精子細胞、管周肌樣細胞、血管平滑肌細胞和間質細胞中均有表達。