檢測(cè)山羊嵴病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立和應(yīng)用

阿比克哈莫，余忠華，景志忠*，湯 承

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2.阿壩藏族羌族自治州動(dòng)物科學(xué)技術(shù)研究所，紅原 624400；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

嵴病毒(kobuvirus,KoV)是小RNA病毒科一個(gè)新的屬。2019年，國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)根據(jù)KoV的Polyprotein、P1、2C和3CD區(qū)氨基酸相似性進(jìn)一步將其劃分為Aichivirus A～F 6個(gè)種以及未分類的挪威鼠嵴病毒、灰松鼠嵴病毒和蝙蝠嵴病毒3個(gè)種[1]。其中，Aichivirus A成員的人愛(ài)知病毒，Aichivirus B成員的牛嵴病毒和Aichivirus C成員的豬嵴病毒為腹瀉病原[2-6]。另外Aichivirus A成員的貓嵴病毒和犬嵴病毒也與腹瀉相關(guān)[7-8]。

目前，在羊中發(fā)現(xiàn)了兩種不同種的KoVs：綿羊嵴病毒(ovine kobuvirus,OKoV)和山羊嵴病毒(caprine kobuvirus,CKoV)，OKoV是Aichivirus B的成員，而CKoV是Aichivirus C的成員[1]。OKoV首次在匈牙利綿羊的健康糞便樣本中檢測(cè)到[9]，隨后在巴西綿羊的健康、腹瀉糞便樣本和愛(ài)爾蘭綿羊腸系膜淋巴結(jié)中都檢測(cè)到了OKoV[7,10]。而CKoV最早是在韓國(guó)黑山羊的腹瀉糞便樣本中檢測(cè)到[11-12]，隨后又在意大利山羊的健康和腹瀉糞便樣本中檢測(cè)到[13]，2019年，ICTV將CKoV確定為Aichivirus C成員[1]。最近本實(shí)驗(yàn)室在四川某地山羊腹瀉山羊糞樣本中檢測(cè)到CKoV，證實(shí)了該病毒在國(guó)內(nèi)的存在，并獲得一個(gè)近似完整的基因組[14]。此外，在意大利鹿的糞樣中也檢測(cè)到CKoV[15]，表明其可能具有跨種間傳播的能力。到目前為止，國(guó)內(nèi)外CKoV流行病學(xué)資料仍然匱乏，并且缺乏合適的分離CKoV的細(xì)胞培養(yǎng)體系，因此該病毒對(duì)山羊的致病性仍不清楚。

目前，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中有3個(gè)CKoV基因組序列，包括本實(shí)驗(yàn)室上傳的1個(gè)中國(guó)毒株。病毒基因組由末端結(jié)合蛋白(vpg)、5′端非編碼區(qū)(5′UTR)、1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)以及3′端非編碼區(qū)(3′UTR)和聚(A)尾組成。3D基因是KoV最為保守的基因，常作為KoV的分子檢測(cè)的靶基因[16-20]。目前關(guān)于CKoV的分子檢測(cè)方法有3篇報(bào)道[11,13,21]，其中兩篇是通過(guò)最為保守的3D基因設(shè)計(jì)的KoV通用引物，通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序來(lái)鑒定種，其特異性和檢測(cè)效率有待于進(jìn)一步評(píng)價(jià)。而特異性檢測(cè)CKoV的分子檢測(cè)方法只有1篇RT-PCR方法的報(bào)道[13]，還未見(jiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。盡管KoV 3D基因保守，但也存在遺傳多樣性，并表現(xiàn)出一定的地域特征[22]。目前，GenBank中CKoV 3D基因序列信息不多，只有3個(gè)完整的CKoV 3D基因和11個(gè)國(guó)外毒株的CKoV 3D基因片段。3個(gè)完整的CKoV 3D基因核苷酸之間的相似性為92.5%～94.4%，而11個(gè)CKoV 3D基因片段核苷酸之間的相似性為68.5%～98.4%，表明CKoV 3D基因存在遺傳多樣性。本試驗(yàn)的目的是建立基于3D基因特異性檢測(cè)CKoV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并調(diào)查CKoV在國(guó)內(nèi)的流行情況。

1 材料與方法

1.1 羊常見(jiàn)病原核酸和臨床樣本

A群羊輪狀病毒(ovine rotavirus，ORoV)、羊腸道病毒(caprine enterovirus,CEoV)、羊星狀病毒(caprine astrovirus，CAoV)、牛星狀病毒(bovine astrovirus,BAoV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、山羊源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC K99、山羊源沙門菌(Salmonella) CVCC528、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis) CVCC3847、山羊源志賀菌(Shigella) CVCC1881菌株、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)的核酸樣本，均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

24份山羊(3月齡以內(nèi))腹瀉糞樣本，于2019年1—12月采自四川成都3個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)，用于比較檢測(cè)方法，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。79份山羊(3月齡以內(nèi))腹瀉糞樣本，于2020年1—4月分別采自西南地區(qū)3個(gè)省市山羊養(yǎng)殖場(chǎng)，其中四川7個(gè)場(chǎng)39份、重慶6個(gè)場(chǎng)35份、云南2個(gè)場(chǎng)5份，用于流行病學(xué)調(diào)查。所有樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

QuickTaqHS DyeMix購(gòu)自TOYOBO東洋紡生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT試劑盒為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker Ⅰ、Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)、TB Green Premix ExTaqⅡ等購(gòu)自TaKaRa公司；核酸染料GoldenView購(gòu)自西安赫特生物；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、Plasmid Mini kit質(zhì)粒小量提取提取試劑盒均為OMEGA公司產(chǎn)品。Doc2000凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為中國(guó)BIOER產(chǎn)品)；Cary50Probe紫外分光光度計(jì)為美國(guó)Vatian公司產(chǎn)品；TGL-16高速冷凍離心機(jī)為中國(guó)蜀科公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

查詢并下載GenBank收錄的CKoV 3D基因序列，共計(jì)11個(gè)部分3D基因和3個(gè)完整的3D基因。利用 MEGA10.0軟件分析比對(duì)3D基因，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，本研究預(yù)期目的片段為176 bp，位于6 874—7 049 nt(GenBank收錄號(hào)MT584793)。由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)相關(guān)引物合成。

表1 4種RT-PCR方法的引物信息Table 1 Primers informations for four kinds of RT-PCR assays

1.4 樣品處理及核酸提取

按糞便樣品∶滅菌PBS(pH 7.2)體積比1∶5制備糞懸液。糞懸液于-80 ℃反復(fù)凍融3次，8 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm一次性濾器過(guò)濾后再取上清300 μL，用TrizolTMReagent試劑盒提取樣本總RNA[23]。提取的RNA用Prime ScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，酚-氯仿法提取DNA[23]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以CKoV SWUN/F11/2019毒株的cDNA為模板，用自行設(shè)計(jì)的特異性引物CKoV F/R(表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。采用25 μL反應(yīng)體系：CKoV F和CKoV R各1.0 μL，模板1.5 μL，EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件同文獻(xiàn)[23]“陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備”。反應(yīng)結(jié)束后，3.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。鑒定正確后，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物并連接至pMD19-T，后續(xù)操作同文獻(xiàn)[23]。最后提取重組質(zhì)粒，送生工生物有限公司測(cè)序，以測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，并按照以下公式換算為拷貝數(shù)，拷貝數(shù)(copies·μL-1)=(6.02×1023copies·mol-1)×(濃度 μg·mL-1)×10-9/(分子質(zhì)量 g·mol-1)。

1.6 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

1.6.1 退火溫度的優(yōu)化 采用20 μL體系：CKoV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1.5 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,dd H2O至20 μL。優(yōu)化判斷標(biāo)準(zhǔn)以最小Ct值、最大產(chǎn)物熒光值、特異性單峰等作為指標(biāo)，選擇50～60 ℃對(duì)退火溫度進(jìn)行10個(gè)梯度的優(yōu)化。

1.6.2 引物用量的優(yōu)化 采用“1.6.1”的反應(yīng)體系以及最佳退火溫度，選擇0.5～1.5 μL間的8個(gè)梯度對(duì)引物(濃度為10 mol·L-1)的用量進(jìn)行優(yōu)化。

條件優(yōu)化后即建立基于TB Green的檢測(cè)CKoV核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

1.7 熔解曲線分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

10倍遞增稀釋CKoV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。用“1.6”建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別對(duì)10-1～10-10遞增稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，同文獻(xiàn)[23]方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照以下公式計(jì)算出擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率(E)=10-1/斜率-1。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的評(píng)價(jià)

1.8.1 特異性評(píng)價(jià) 用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)常見(jiàn)羊病病原的核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，以RNase Free ddH2O作為陰性對(duì)照。

1.8.2 穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 分別取等量的2.23×104、2.23×105和2.23×106copies·μL-1的重組質(zhì)粒，按上述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；同取以上3份樣品，在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的檢測(cè)，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.8.3 敏感性測(cè)定 以101～1010稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以RNase Free ddH2O為陰性對(duì)照，按上述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.8.4 4種方法的比較 采用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和常用于檢測(cè)KoV的3種RT-PCR方法[11，13，21]分別平行對(duì)24份山羊腹瀉糞樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較其檢出率，引物信息見(jiàn)表1，全部的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送生工生物有限公司測(cè)序。

1.9 臨床樣本中CKoV的檢測(cè)

利用本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)79份山羊腹瀉糞樣本進(jìn)行CKoV的檢測(cè)，從陽(yáng)性樣本中隨機(jī)挑選20%進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的正確性。

1.10 CKoV完整的3D基因序列擴(kuò)增及分析

自行設(shè)計(jì)2對(duì)引物分段擴(kuò)增完整的3D基因，引物序列如下，F(xiàn)1:5′-CGTTGTCGGCTCTTCTGGCTTCT-3′,R1:5′- CTATGCGAAAAGCACA- GGAGGGA-3′;(6 500—7 329 nt,GenBank收錄號(hào)：MT584793);F2′:5′-GTGACGGCGGGAC-TTACCAGAG-3′;R2:5′- GGGTGAAACGCCTGGGAAGAG-3′ (7 083—8 078 nt,GenBank收錄號(hào)：MT584793)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。分段擴(kuò)增CKoV陽(yáng)性樣本3D基因，擴(kuò)增的目的片段經(jīng)膠回收，連接至pMD19-T載體后，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒送往上海生工生物有限公司測(cè)序。

使用SeqMan software軟件拼接3D基因序列，使用DNASTAR7.0軟件中的MEGAlign程序測(cè)定核苷酸序列和推斷氨基酸序列的相似性，使用MEGA 7.0軟件以Neighbor-Join法(Bootstrap值為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 引物的特異性驗(yàn)證

用自行設(shè)計(jì)的特異性引物從SWUN/F11/2019毒株cDNA中擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段(圖1)，測(cè)序結(jié)果證明目的片段長(zhǎng)度為176 bp，符合預(yù)期結(jié)果，與GenBank中CKoV 3D基因的相似性為100%，為CKoV 3D基因的特異序列。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);-.陰性對(duì)照；+.陽(yáng)性樣品M.Gene ruler ultra-low range DNA ladder;-.Negative control；+.CKoV positive sample圖1 引物擴(kuò)增片段電泳鑒定Fig.1 Gel electrophoresis of amplification fragment by specific primers

2.2 優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件

優(yōu)化后的20 μL反應(yīng)體系：上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。

優(yōu)化后的反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s，循環(huán)1次，反應(yīng)結(jié)束。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線

紫外分光光度計(jì)測(cè)得陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為70 ng·μL-1，換算后相應(yīng)拷貝數(shù)為2.23×1010copies·μL-1。按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，本試驗(yàn)建立的方法在陽(yáng)性模板濃度為2.23×102～2.23×108copies·μL-1之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2 A)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.110 6x+ 38.09，相關(guān)系數(shù)R2值為0.999 2，擴(kuò)增效率為110%。結(jié)果說(shuō)明該方法線性關(guān)系良好、擴(kuò)增效率好。熔解曲線結(jié)果(圖2 B)顯示，PCR產(chǎn)物在87 ℃左右均出現(xiàn)單一波峰，無(wú)引物二聚體和非特異擴(kuò)增峰。用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物對(duì)同一模板的3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致，證明該方法有良好的重復(fù)性(結(jié)果未展示)。

圖2 CKoV real-time PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)及熔解曲線(B)Fig.2 Standard curve (A) and melting curve (B) of real-time PCR for CKoV

2.4 方法的特異性

本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法僅對(duì)CKoV具有良好的擴(kuò)增曲線，不擴(kuò)增其他無(wú)關(guān)病原(圖3)。

1.CKoV標(biāo)準(zhǔn)品模板；2～13.ORoV、CEoV、CAoV、BAoV、BVDV、BCoV、ETEC K99、山羊源沙門菌、奇異變形桿菌、山羊源志賀菌、枯草芽胞桿菌、糞腸球菌；N.陰性對(duì)照1.CKoV positive samples;2-13.ORoV,CEoV,CAoV,BAoV,BVDV,BCoV,ETEC K99,Salmonella,Proteus mirabilis,Shigella,Bacillus subtilis,Enterococcus faecium;N.Negative control圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性Fig.3 The specificity test of the real time fluorescent quantitative PCR

2.5 方法的穩(wěn)定性

本次所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法批內(nèi)變異系數(shù)CV為0.56%～0.87%，批間變異系數(shù)為0.43%～0.86%(表2)，表明該方法的檢測(cè)穩(wěn)定性良好。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性(n=3)Table 2 Stable test of real time fluorescent quantitative PCR (n=3)

2.6 方法的敏感性

將2.23×1010copies·μL-1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒作10倍遞增稀釋，以101～1010稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)以等量RNase Free ddH2O代替模板作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，101～109稀釋度范圍內(nèi)均具有特異性擴(kuò)增曲線，該方法所能檢出的最低拷貝數(shù)為22.3 copies·μL-1(圖4)。

1～10.2.23×109～2.23×100；N.陰性對(duì)照1-10.2.23×109～2.23×100；N.Negative control圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性Fig.4 The sensitivity test of the real time fluorescent quantitative PCR

2.7 四種檢測(cè)方法的比較

4種檢測(cè)方法對(duì)24份山羊腹瀉糞樣本中CKoV的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，本試驗(yàn)所建方法的檢出率明顯高于文獻(xiàn)里其他3種方法(P<0.05)，且作者建立方法檢出的陽(yáng)性樣本包括了其他3種方法所檢出的所有陽(yáng)性樣本。本方法檢出的全部陽(yáng)性樣本的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證實(shí)均為CKoV的目的基因片段。

2.8 山羊腹瀉糞樣本中CKoV的檢出率

對(duì)79份山羊腹瀉糞樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，CKoV平均陽(yáng)性率為25.3%，平均場(chǎng)陽(yáng)性率53.3%。四川山羊糞樣本中CKoV的檢出率為30.84%，場(chǎng)陽(yáng)性率為57.1%；重慶山羊糞樣本中CKoV的檢出率為8.6%，場(chǎng)陽(yáng)性率為33.3%；云南山羊糞樣本中CKoV的檢出率為100%，場(chǎng)陽(yáng)性率為100%。隨機(jī)挑選的20%陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證實(shí)均為目的片段，進(jìn)一步證明該方法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.9 CKoV 3D完整基因的克隆

從四川和云南共5個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)的CKoV陽(yáng)性糞樣本中成功克隆出大小為1 404 bp的13個(gè)完整的3D基因，編碼468個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào):MW187484～MW187496)。這13個(gè)3D基因間的核苷酸相似性為99.6%～100%，氨基酸相似性為99.6%～100%，與GenBank中的僅有的3個(gè) CKoV完整的3D基因核苷酸相似性為92.3%～100%，氨基酸相似性為98.5%～100%，與GenBank中11個(gè)CKoV 3D基因片段的相似性為70.1～92.9%，氨基酸相似性為83.6～98.4%。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這13株CKoV 3D基因與GenBank中唯一的中國(guó)CKoV毒株的3D基因共同聚為單獨(dú)的一個(gè)大支(圖5)，表明了國(guó)內(nèi)CKoV 3D基因具有獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì)。與GenBank中另外2個(gè)CKoV完整的3D基因序列相比，14個(gè)中國(guó)毒株的完整3D基因序列有59個(gè)共同的核苷酸突變，其中9個(gè)為有義突變，導(dǎo)致了3個(gè)氨基酸的突變(E43G、D252E和T368S)。

●.本研究毒株；▲.本實(shí)驗(yàn)室前期克隆的1個(gè)中國(guó)毒株● marks the strain in this study,▲ marks the Chinese strain previously cloned in our laboratory圖5 CKoV完整3D基因的鄰近法演化樹Fig.5 Neighbor-joining consensus tree for CKoV complete 3D gene

3 討 論

KoV是人和多種動(dòng)物的腹瀉病原[2,4-5,18-19]，常用的KoV檢測(cè)方法的靶基因均為3D基因[8,24-26]。盡管3D基因在KoV成員中相對(duì)保守，但也存在遺傳多樣性，并表現(xiàn)出一定的地域特征[22,24]。研究表明KoV 3D基因核苷酸的平均替換率為2.64×102替換·(位點(diǎn)·年)-1[27]。目前檢測(cè)CKoV的方法有3篇文獻(xiàn)報(bào)道[11,13,21]。Melegari等[13]以3D基因?yàn)榘谢虻奶禺愋詸z測(cè)CKoV的RT-PCR方法，該RT-PCR方法的上游引物(21個(gè)堿基)擴(kuò)增位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)唯一上傳的1個(gè)完整CKoV 3D基因序列的第4位發(fā)生突變(T→C)，而下游引物(22個(gè)堿基)擴(kuò)增位點(diǎn)在第2、5、17位發(fā)生突變(C→T，G→C，C→T)，這些堿基突變很可能會(huì)影響擴(kuò)增效率。Lee等[11]以人愛(ài)知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1 共保守的3D基因設(shè)計(jì)引物的RT-PCR方法，Reuter等[21]以人愛(ài)知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1以及豬嵴病毒S-1-HUN共保守的3D基因設(shè)計(jì)引物的RT-PCR方法，這兩種方法通用引物的擴(kuò)增位點(diǎn)均與我國(guó)毒株不完全匹配，并且均需PCR測(cè)序來(lái)鑒定種，其特異性也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究根據(jù)CKoV流行毒株的3D基因建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，具有良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，與國(guó)外上述3種檢測(cè)CKoV的RT-PCR方法相比，極大地提高了臨床樣本中CKoV的檢出率，為CKoV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。

CKoV作為山羊新發(fā)病毒，其流行病學(xué)資料仍然匱乏。本試驗(yàn)用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)2020年1—4月四川、云南和重慶共15個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)的79份山羊腹瀉糞樣本進(jìn)行了檢測(cè)，山羊CKoV的檢出率為25.31%，場(chǎng)陽(yáng)性率為53.3%，證明該病毒已在上述地區(qū)山羊中廣泛流行。由于臨床樣本均來(lái)自于山羊腹瀉糞樣本，未采集山羊健康糞樣本作對(duì)照，所以CKoV與腹瀉之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步調(diào)查。盡管CKoV的致病性不清楚，但多種KoVs，如人愛(ài)知病毒、牛嵴病毒和豬嵴病毒等是導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉的重要病原，因此有必要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步調(diào)查CKoV在國(guó)內(nèi)的流行情況以及與山羊腹瀉間的聯(lián)系。

目前，GenBank中有3個(gè)完整的3D基因，包括本實(shí)驗(yàn)室前期上傳的1個(gè)中國(guó)毒株。本研究成功獲得了13個(gè)國(guó)內(nèi)流行毒株完整的3D基因序列，為CKoV的檢測(cè)方法的建立和遺傳進(jìn)化分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。進(jìn)化分析已有的14個(gè)中國(guó)毒株完整3D基因的序列，發(fā)現(xiàn)這些毒株共同聚為單獨(dú)的一個(gè)大支，與國(guó)外毒株具有顯著的遺傳距離，說(shuō)明中國(guó)毒株具有獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì)(圖5)，這可能與地域、環(huán)境和自然選擇模式等壓力有關(guān)[22,27]。3D基因編碼區(qū)含有高度保守的氨基酸序列KDELR、YGDD 和FLKR，作為病毒依賴RNA的聚合酶在KoV增殖中起關(guān)鍵作用[28]。14個(gè)中國(guó)株的完整3D基因編碼的氨基酸序列與GenBank中另外2個(gè)國(guó)外3D氨基酸序列相比，有3個(gè)共同的氨基酸突變，但它不在RNA的聚合酶區(qū)域，這種獨(dú)特的氨基酸突變是否會(huì)影響3D基因的分子功能需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

作者基于3D基因成功建立了特異性檢測(cè)CKoV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，特異性和重復(fù)性好，靈敏性高，為CKoV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。并且，CKoV已在四川、云南和重慶3省腹瀉山羊中廣泛流行，其3D基因具有獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì)。