枯草芽胞桿菌DarA蛋白的鑒定及其原核表達(dá)

于秀菊，孫 錚，韓小濤，李鈺鈺，于 淼，董常生*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

芽胞桿菌是一類常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，是動(dòng)植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)菌之一，不僅種類繁多，而且來(lái)源廣泛，存在于土壤、海洋、植被、食物及動(dòng)物腸道等多種樣品中[1-2]，其產(chǎn)生的芽胞可在高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等多種極端環(huán)境中生存，具有較強(qiáng)的耐受能力[3-4]。芽胞桿菌代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素分為修飾后細(xì)菌素(Ⅰ類)、無(wú)修飾細(xì)菌素(Ⅱ類)和具有磷酸酶活性的大分子蛋白(Ⅲ類)，而有些在遺傳、分子或氨基酸結(jié)構(gòu)等方面缺乏數(shù)據(jù)，無(wú)法按照分類法進(jìn)行分類的抗菌蛋白，統(tǒng)稱為類細(xì)菌素[5]。芽胞桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和類細(xì)菌素是繼乳酸菌細(xì)菌素之后的又一類重要的細(xì)菌素[6]，與乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素相比，芽胞桿菌細(xì)菌素抗菌譜更廣，包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、酵母和真菌，并且具有耐酸堿、耐高溫的特性。這些特性提示了芽胞桿菌產(chǎn)生的(類)細(xì)菌素具有廣泛的應(yīng)用前景[7-8]。

據(jù)研究報(bào)道，多種芽胞桿菌可以代謝產(chǎn)生細(xì)菌素或類細(xì)菌素，例如地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)和凝結(jié)芽胞桿菌(B.coagulans)等[5]。近十年，從芽胞桿菌中分離出的細(xì)菌素或類細(xì)菌素有50余種，如Xin等[9]從分離自藏豬腸道的枯草芽胞桿菌TS的發(fā)酵產(chǎn)物中純化到細(xì)菌素TP，該細(xì)菌素為相對(duì)分子質(zhì)量約1.5 ku的肽，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性；Ayed等[10]從解淀粉芽胞桿菌An6發(fā)酵產(chǎn)物中分離到約11 ku的類細(xì)菌素，該類細(xì)菌素在pH 4.0～10.0條件下仍具有抑菌活性；Sharma等[11]對(duì)枯草芽胞桿菌GAS101所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌活性和作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌和表皮葡萄球菌具有抑制作用，且具有耐高溫、耐酸堿的特點(diǎn)。但由于(類)細(xì)菌素是細(xì)菌產(chǎn)生的天然成分，與眾多物質(zhì)混合，成分不單一，存在分離純化難度大、產(chǎn)量低等問(wèn)題。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行體外表達(dá)是獲得足量(類)細(xì)菌素的有效途徑[12]。

羊駝原產(chǎn)于安第斯高原地區(qū)的惡劣環(huán)境下，具有抗寒、抗旱、抗病力強(qiáng)且可自然產(chǎn)生單域抗體等優(yōu)良特性，羊駝的這些特性與其體內(nèi)特定的微生物菌群有著密切的關(guān)系。本研究從羊駝糞便中分離到1株 產(chǎn)抑菌物質(zhì)的枯草芽胞桿菌菌株SXAU18，分離純化后預(yù)測(cè)其產(chǎn)生的抗菌蛋白的基因序列，通過(guò)原核表達(dá)獲得具有生物活性的DarA重組蛋白。本研究將為DarA的功能研究和作為抗菌蛋白的應(yīng)用奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

枯草芽胞桿菌SXAU18的分離：在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝繁育基地，隨機(jī)采取10頭羊駝的糞便，參照相關(guān)研究報(bào)道的方法[9]，將羊駝糞便按照0.2 g·頭-1進(jìn)行混合，加入PBS制成均勻的懸液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后進(jìn)行梯度稀釋，涂布于LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。通過(guò)菌落的形態(tài)、大小和顏色等菌落特征的觀察和革蘭染色后鏡檢，挑選可疑菌落。劃線純化4次后，牛津杯擴(kuò)散法測(cè)定挑選菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性。挑選抑菌效果最好的菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，結(jié)果表明，該菌為枯草芽胞桿菌，將其命名為枯草芽胞桿菌SXAU18。

指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC44102、沙門菌(SalmonellaparatyphiA)CMCC(B)50001、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26003、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC(B)26069、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)CMCC(B)28001，單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111，保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 枯草芽胞桿菌SXAU18的抑菌活性

將枯草芽胞桿菌SXAU18活化后，按照1∶100的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，10 000×g4 ℃離心20 min，收集上清液，用0.22 μm濾器過(guò)濾獲得無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)上清。參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的總蛋白濃度。

參照文獻(xiàn)[13-14]采用牛津杯擴(kuò)散法測(cè)定SXAU18培養(yǎng)上清的抑菌活性。步驟如下：①培養(yǎng)板中倒入大約10 mL的2%瓊脂培養(yǎng)基制成下層培養(yǎng)板；②在下層板上間隔合適距離放置牛津杯，15 mL 的0.75%軟的TSA培養(yǎng)基(胰蛋白胨15.0 g·L-1，大豆蛋白胨5.0 g·L-1，氯化鈉30.0 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1)或者15 mL的0.75%的BHI(腦心浸液)培養(yǎng)基，冷至55～60 ℃時(shí)，加入指示菌107CFU·mL-1，倒入下層培養(yǎng)基上，待上層凝固后，拔出牛津杯，形成上層板；③在孔中加入180 μL無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清，并以LB培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

1.3 抑菌物質(zhì)的分離純化

硫酸銨沉淀：無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液1 L，用飽和度為50%的硫酸銨鹽析，在室溫下用磁力攪拌器攪拌6 h，10 000×g，4 ℃離心20 min，沉淀溶于1/40體積的PBS中。氯仿抽提：收集到的樣品與氯仿按照1∶1體積比例混合，震蕩15 min，4 500×g離心10 min，棄掉上層和下層相，收集中間相，真空濃縮儀(Eppendorf,Saxony,GER)干燥后用1/2體積PBS重懸干燥沉淀物。分子截留：收集到的樣品利用10 ku cut-off和3 ku cut-off超濾離心管(Millipore,Massachusetts,USA)3 000×g4 ℃離心，獲得10 ku以上、3～10 ku和3 ku以下三段蛋白液；SDS-PAGE分離：具有抑菌活性的蛋白液通過(guò)4%～20% SDS-PAGE(Sigma-Aldrich,TruPAGETMPrecast Gel System)電泳，一個(gè)泳道進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，另一個(gè)泳道用0.1% Tween 80清洗，30 min·次-1，洗3次，之后MilliQ水清洗30 min 除去SDS，將清洗后的膠條放置到LB固體平板上，在上層傾倒含有100 μL (OD600 nm=0.6)指示菌的0.75%TSA軟固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)定抑菌效果。以金黃色葡萄球菌為指示菌，在分離純化的每一步后均進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.4 質(zhì)譜及生物信息學(xué)分析

切下具有抑菌活性的SDS電泳條帶，送至華大基因，做質(zhì)譜分析。通過(guò)UltiMate3000 (Dionex)和Q Exactive (Thermo Fisher Scientific,Millipore,Massachusetts,USA) LC-MS/MS 質(zhì)譜儀系統(tǒng)進(jìn)行蛋白序列分析。獲得序列運(yùn)用Mascot軟件(Matrix Science)進(jìn)行UniProt分析。通過(guò)NCBI和ExPASy-ProtParam tool對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其抑菌蛋白的氨基酸序列。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化合成預(yù)測(cè)抗菌蛋白的基因序列。

1.5 重組質(zhì)粒pCold-I-DarA的構(gòu)建

根據(jù)抗菌蛋白優(yōu)化后的基因序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載體的特異性引物，上游引物引入HamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入SalⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列，F(xiàn)：5′- TAACGGGATCCATTGTTGCCGTGGTTCA- GGA-3′，R：5′- TTGATGTCGACGAACTGATGGAATTCATCCA-3′。以優(yōu)化序列為模板，PCR擴(kuò)增基因序列。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，用HamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的pCold-I表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取3個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，將鑒定正確的陽(yáng)性克隆接種于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜提取重組質(zhì)粒pCold-I-DarA。

1.6 DarA蛋白的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pCold-I-DarA轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)胞中，測(cè)序鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌液按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接于含Amp的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至OD≈0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑，同時(shí)設(shè)定不加誘導(dǎo)劑的對(duì)照組，15 ℃ 150 r·min-1誘導(dǎo)12 h。離心收集菌體，用PBS重懸菌體，吹打均勻，超聲破碎，離心收集超聲后的上清和沉淀。進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.7 重組DarA蛋白的純化

將超聲上清液上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B親和層析柱，用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH8.0)洗脫雜蛋白，之后，用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH8.0)洗脫目的蛋白。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS進(jìn)行透析過(guò)夜。純化樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE和Western blotting分析。

1.8 表達(dá)純化后DarA的活性鑒定

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌作為指示菌，采用牛津杯擴(kuò)散法對(duì)重組蛋白的活性進(jìn)行鑒定。同時(shí)設(shè)定氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照。分別在孔中加入180 μL的待測(cè)樣品，將抑菌平板放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約12 h，觀察并記錄抑菌效果。

2 結(jié) 果

2.1 SXAU18發(fā)酵上清的抑菌效果

分離自羊駝糞便中的枯草芽胞桿菌SXAU18，經(jīng)培養(yǎng)獲得該菌株的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清，BCA蛋白濃度測(cè)定其總蛋白的濃度為1.04 μg·μL-1，指示菌的抑菌作用見(jiàn)表1，結(jié)果顯示，該菌所產(chǎn)上清對(duì)革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌具有顯著的抑菌活性(表1)。

表1 SXAU18所產(chǎn)類細(xì)菌素對(duì)指示菌的抑菌活性檢測(cè)Table 1 Effect of bacterocin-like substance produced by SXAU18 on indicators antimicrobial activity

2.2 抗菌蛋白的純化結(jié)果

對(duì)枯草芽胞桿菌SXAU18所產(chǎn)抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化。1 L無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液通過(guò)飽和50%的硫酸銨鹽析得到25 mL粗提液，其抑菌活性見(jiàn)圖1A；粗提液通過(guò)氯仿抽提后進(jìn)行分子截留和濃縮，獲得相對(duì)分子質(zhì)量3 ku以下、3～10 ku之間和10 ku 以上3個(gè)蛋白大小的蛋白濃縮液，抽提液和濃縮液的抑菌活性測(cè)定分別見(jiàn)圖1B和1D。圖1D顯示，抑菌蛋白相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在10 ku以上。進(jìn)而將相對(duì)分子質(zhì)量大于10 ku的蛋白液做SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在大約15 ku產(chǎn)生明顯的抑菌區(qū)域(圖1E)，純化結(jié)果顯示，該菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)是10～20 ku的蛋白質(zhì)。

2.3 抑菌蛋白的質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析

質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：枯草芽胞桿菌SXAU18所產(chǎn)活性物質(zhì)含有特定的氨基酸序列——GSSIFGLAPGK。UniProt、NCBI和ExPASy-ProtParam tool分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：抑菌蛋白可能為環(huán)二腺嘌呤核苷酸受體A(c-di-AMP receptor A)，其是枯草芽胞桿菌中第二信使“(c-di-AMP)”的主要受體蛋白之一。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)抑菌蛋白的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的序列為：ATTGTTGCCGTGGTTCAGGATCAGGATAGCAATCGC- CTGCTGAAAACCTTAACCGATCATAACTTC- CGCGTTACCAAACTGGCAACCACCGGCGGCT- TCCTGAAAAGTGGTAATACCACCTTCATGA- TTGGCGTGGAAGATATTCGCGTTAATAAAG- CACTGAGCCTGATTAAAGAAAATGGTCAGA- AACGTGATCAGATGATTGCCCCGGTTAGCC- CGATGGGTGGCAATGCAGATAGTTATGTT- CCGTATCCGGTGGAAGTGGAAGTTGGCGGT- GCAACCGTGTTCGTGCTGCCGGTGGATGAA- TTCCATCAGTTC。

2.4 DarA的原核表達(dá)和純化

SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，外源誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白DarA是以可溶性上清蛋白和包涵體兩種形式存在，且主要以可溶性上清蛋白形式表達(dá)(圖2A)。重組蛋白DarA純化后的SDS-PAGA分析結(jié)果顯示，純化后的DarA蛋白為單一條帶(圖2B)。Western blot結(jié)果表明：重組表達(dá)的DarA蛋白能夠與鼠抗HIS單克隆抗體特異性結(jié)合，蛋白大小約為12 ku(圖2C)，與預(yù)計(jì)大小相符。

A.硫酸銨沉淀后的抑菌活性；B.氯仿抽提后的抑菌活性；C.PBS陰性對(duì)照；D.超濾后的各個(gè)組分的抑菌活性；E.10 ku以上蛋白液的SDS電泳和抑菌活性分析(a.SDS電泳；1.低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn);2.樣品；b.膠條在10～25 ku大小對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌區(qū)域)A.Antibacterial activity of ammonium sulfate precipitation;B.Antibacterial activity of chloroform extraction;C.Negative control;D.Antibacterial activity of ultrafiltration collection;E.SDS-PAGE analysis of purified protein solution over 10 ku and detection of antibacterial activity on gel (a.SDS-PAGE;1.1.7-40 ku low-range protein ladder;2.Sample;b.Gel overlaid with S.aureus showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over 10-25 ku band)圖1 枯草芽胞桿菌SXAU18所產(chǎn)類細(xì)菌素在分離純化過(guò)程中的抑菌活性測(cè)定(以金黃色葡萄球菌為指示菌)Fig.1 Antibacterial activity assay of purification process of bacterocin-like substance produced by Bacillus subtilis SXAU18(S.aureus as indicator bacteria)

A.重組蛋白DarA原核表達(dá)SDS電泳圖(M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo)組;2.誘導(dǎo)組;3.誘導(dǎo)組超聲波破碎后上清;4.誘導(dǎo)組超聲波破碎后沉淀);B.重組蛋白DarA純化的SDS電泳圖(M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.超聲波破碎后的樣品；2.流出；3.洗脫);C.純化后DarA的Western blot結(jié)果 (M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.純化樣品)A.SDS-PAGE of DarA protein expression (M.Protein marker;1.Non-induced group;2.Induced group;3.Supernatant after induction of fragmentation;4.Precipitation after induction of fragmentation);B.SDS-PAGE analysis of DarA fusion protein purification (M.Protein marker;1.Samples after ultrasonic breaking;2.Flow-through;3.Elution);C.Western blot analysis of DarA fusion protein purification (M.Protein marker;1.Purified sample)圖2 DarA 重組蛋白表達(dá)和純化的SDS電泳和Western blot分析Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of DarA protein expression and purification

2.5 重組蛋白DarA的抑菌活性鑒定

抑菌鑒定結(jié)果顯示：重組蛋白DarA對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均產(chǎn)生明顯的抑菌環(huán)(圖3A、B)。同時(shí)，PBS陰性對(duì)照孔周圍的細(xì)菌生長(zhǎng)未受到抑制(圖3C、D)。Amp陽(yáng)性對(duì)照孔周圍的細(xì)菌生長(zhǎng)受到了明顯的抑制(圖3E、F)，結(jié)果表明：由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生的DarA蛋白具有抑菌活性。

A.DarA對(duì)金黃色葡萄球菌的作用;B.DarA對(duì)單增李斯特菌的作用;C、D.PBS陰性對(duì)照組;E、F.氨芐青霉素陽(yáng)性對(duì)照組A.Inhibitory activity against S.aureus of DarA;B.Inhibitory activity against L.monocytogenes of DarA;C,D.PBS negative control;E,F.Ampicillin positive control圖3 重組DarA蛋白的抑菌活性分析Fig.3 Antibacterial activity of recombinant protein DarA

3 討 論

拮抗菌是自然存在的抑制有害病原菌的菌群，具有對(duì)人畜安全，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，不易使病原微生物產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，也是獲取抗菌物質(zhì)的重要生物資源[5]?？莶菅堪麠U菌作為農(nóng)業(yè)部允許在飼料中添加的益生菌之一，具有耐高溫、耐酸堿、易培養(yǎng)、抗逆性好、加工損失少的特點(diǎn)[15]，屬于非腸道固有菌群，在自然界中分布廣泛。近年來(lái)，越來(lái)越多的芽胞桿菌菌株及其所產(chǎn)(類)細(xì)菌素被分離和應(yīng)用。例如，Xin等[9]從藏豬腸道中分離得到一株芽胞桿菌菌株TS，并分離到抗菌肽TP。Wu等[16]從淀粉芽胞桿菌菌株ZJHD3-06中分離出抑制李斯特菌生長(zhǎng)的細(xì)菌素CAMT2。益生芽胞桿菌或所產(chǎn)益生素在雞、豬、羊體內(nèi)的試驗(yàn)結(jié)果表明，其具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)腸道發(fā)育和提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用[17-19]。本研究從羊駝糞便中篩選到一株枯草芽胞桿菌SXAU18，該菌的發(fā)酵上清對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。

為驗(yàn)證DarA是否具有抗菌功能，需要獲得較純的DarA蛋白。根據(jù)枯草芽胞桿菌SXAU18發(fā)酵上清對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有抑制生長(zhǎng)的作用，對(duì)革蘭陰性菌基本沒(méi)有作用的特點(diǎn)，本研究選擇原核表達(dá)系統(tǒng)作為表達(dá)體系，同時(shí)，為提高重組蛋白的表達(dá)量和分泌表達(dá)蛋白比例[25-26]，按照大腸桿菌的密碼子偏好性對(duì)DarA的基因序列進(jìn)行了優(yōu)化[27]，并以pCold-I作為表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，從而降低包涵體的表達(dá)比例，最終獲得了良好的表達(dá)效果。

芽胞桿菌細(xì)菌素分類法將其細(xì)菌素分為3類：Ⅰ類細(xì)菌素，以羊毛硫菌素或環(huán)狀為特征；Ⅱ類細(xì)菌素，是一類小分子(0.77～10 ku)的線性肽；Ⅲ類細(xì)菌素，相對(duì)分子質(zhì)量大于30 ku蛋白。其他許多中等大小的抗菌多肽(10～30 ku)和其他由桿菌產(chǎn)生的大的抗菌蛋白，無(wú)法按照分類法進(jìn)行分類，被稱為類細(xì)菌素[5]。本研究獲得的DarA重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小約為12 ku，加之Gundlach等[24]報(bào)道的DarA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，DarA應(yīng)屬于芽胞桿菌類細(xì)菌素的一種。

本研究所得結(jié)果為DarA的功能研究和作為抑菌蛋白的應(yīng)用奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

從羊駝糞便中分離到枯草芽胞桿菌SXAU18，該菌株能夠發(fā)酵產(chǎn)生抑制金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌生長(zhǎng)的類細(xì)菌素DarA，重組表達(dá)后的DarA具有抑菌活性。