甘草酸對多重耐藥大腸桿菌的抗菌增敏作用

張 鵬，王春光，張子闖，呂建存，王文靜，姚姍姍，劉靜茹，趙子玉，張 鐵*

(1.河北農業大學動物醫學院，保定 071000；2.江西農業大學動物科技學院，南昌 330000)

1940年,Abraham和Chain[1]從大腸桿菌菌體內發現第一種水解青霉素酶，首次報道大腸桿菌耐藥性，自此大腸桿菌耐藥性逐步引起廣泛關注，2012年，Su等[2]從中國南方地區分離3 456株大腸桿菌，其耐藥率達到了89.1%，其中,87.5%菌株具有多重耐藥性。大腸桿菌的多重耐藥性多與RND型外排泵過表達有關[3]，其中,AcrAB-TolC是大腸桿菌最主要的RND型外排泵[4]。

AcrAB-TolC外排泵是由AcrA、AcrB和TolC 3部分構成的復合物，融合蛋白(AcrA)存在于細菌胞質間隙，兩端分別連接內膜轉運蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。其中,AcrB蛋白由3個AcrB原體聚合成一同源三聚體結構，位于細胞內膜，當藥物進入細菌的細胞質內，會被其捕獲，并將藥物分子轉運至膜外[5]。如果AcrB的外排機制受到干擾或抑制，將會使得進入菌體內的藥物分子不斷積聚，從而恢復現有抗菌藥物的殺菌效能。因此，AcrB是十分理想的外排泵抑制劑靶點。

RND型外排泵能量來源質子濃度梯度[6]，質子載體羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)是最典型的質子泵抑制劑，主要通過降低跨膜電位來抑制外排泵的活性，但是CCCP是非特異性外排泵抑制劑，不能確定外排泵的種類。目前，已知的大腸桿菌AcrB外排泵抑制劑有PAβN[7]、吡喃并吡啶化合物MBX2319(9)[8]、吡啶并咪唑類化合物D13-9001[9]等，這些抑制劑毒性較大，沒有相關臨床應用的報道，因此尋找安全的外排泵抑制劑有望成為解決大腸桿菌多重耐藥的重要途徑之一。

本試驗利用計算機虛擬篩選從中藥單體數據庫中得到AcrB外排泵抑制劑——甘草酸，并通過尼羅紅外排、外膜滲透穩定性、內膜質子梯度影響、AcrB 調控基因表達等試驗闡明其作用機制，為耐藥菌臨床防治提供一種有潛質的外排泵抑制劑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

禽源多重耐藥大腸桿菌E320分離自臨床大腸桿菌病雞(本實驗室測序并保存，NCBI登錄號：CP020933，對頭孢噻肟、氯霉素、慶大霉素、左氧氟沙星等多種抗生素耐藥)、大腸桿菌ATCC35218、ATCC25922均購自美國組織細胞收藏中心(ATCC)，頭孢噻肟鈉(2 560 μg·mL-1)、磷霉素鈉、氯霉素購自北京酷來搏科技有限公司，甘草酸(98%)、多黏菌素B、頭孢噻肟鈉購自上海邁瑞爾化學技術有限公司，頭孢噻吩購自美侖生物技術有限公司，PAβN(≥99%)購自上海麥克林生化科技有限公司，羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)、尼羅紅購自北京索萊寶科技有限公司，RNAisoPlus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa公司，DioC2(3)購自Abbkine生物技術有限公司，熒光分光光度計(JascoFP-750)購自日本Jasco公司，LyightCyler實時熒光定量PCR儀購自羅氏公司。

1.2 AcrB蛋白和中藥單體化合物的結構處理

大腸桿菌AcrB蛋白晶體結構(PDBID：2 drd)從PDB(Protein Data Bank,www.rcsb.org)下載。用AutoDockTools(The Scripps Institute)進行處理，刪除水分子，加電荷、加氫原子，并轉換成pdbqt格式。中藥單體化合物結構從ZINC數據庫(http://zinc.docking.org)下載，并轉換成pdbqt格式。

1.3 AcrB外排泵抑制劑虛擬篩選及作用力分析

通過AutoDoockTools的Grid Box工具找到2 drd 蛋白的活性口袋，用PyRx(The Scripps Institute)運行Autodock Vina完成虛擬篩選，并應用DS Visualizer(BIOVIA)進行作用力分析。

1.4 聯合抑菌試驗

采用微量肉湯二倍稀釋法[10]，用MHB營養肉湯分別測定甘草酸、抗生素對大腸桿菌E320與大腸桿菌ATCC25922的最小抑菌濃度(MIC)。

采用微量棋盤稀釋法對大腸桿菌E320進行藥物體外聯合抑菌試驗[11]，在縱橫兩個方向上以甘草酸、抗生素的MIC為初始濃度，對甘草酸和抗生素分別進行倍比稀釋，每孔加入大腸桿菌菌液使終濃度為5×105CFU·mL-1，37 ℃培養20 h，以無細菌生長的最低藥物濃度為聯合用藥MIC，計算分級抑菌濃度指數(FICI)，判定聯合用藥效果。

FICI=MIC(甘草酸聯合用藥)/MIC(甘草酸單用)+MIC(抗生素聯合用藥)/MIC(抗生素單用)

判定標準：FICI≤0.5判定為協同作用，0.52判定為拮抗作用[12]。

1.5 尼羅紅外排試驗

試驗分為4個組，分別為甘草酸3.125 mg·mL-1組、甘草酸6.25 mg·mL-1組、PAβN 25 mg·L-1(陽性AcrB抑制劑)組和空白對照組。將E320菌株培養14 h(37 ℃ 200 r·min-1)，在室溫下，4 400 r·min-1離心10 min，棄上清，在含有1 mmol·L-1MgCl2的50 mmol·L-1K3PO3緩沖液(pH=7)中洗滌3次，隨后，將細菌懸浮在上述緩沖液中至OD660 nm=1.0，靜置15 min，然后，分別將3 mL 樣品轉移到4 mL離心管中，并且分別加入羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)使終濃度為10 μmol·L-1，靜置15 min后，加入甘草酸或PAβN至所需終濃度，空白對照組加入等量生理鹽水，混勻靜置15 min，4 400 r·min-1離心5 min，棄上清，重懸在3 mL 上述緩沖液中，轉到15 mL離心管中，加入尼羅紅使終濃度為10 μmol·L-1，在振蕩器(37 ℃ 140 r·min-1)上孵育3 h。隨后將細胞在室溫下靜置60 min，4 400 r min-1離心5 min。棄上清，用吸水紙吸去管壁上的液滴，將細胞重懸于3 mL PBS中，轉移到比色皿中。熒光分光光度計中測量熒光信號，調節激發波長為544 mm，發射波長為650 mm，激發狹縫寬度為10 nm，發射狹縫寬度為5 nm。監測細胞懸液的熒光強度，100 s后加入50 mmol·L-1葡萄糖，觀察其300 s后的熒光強度變化[13]。

1.6 外膜滲透穩定性試驗

試驗分為4個組，分別為甘草酸 3.125 mg·mL-1組、甘草酸6.25 mg·mL-1組、陽性對照和空白對照組。將ATCC35218菌株培養14 h(37 ℃ 200 r·min-1)，在室溫下,4 400 r min-1離心10 min，棄上清，懸浮于50 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)中，洗滌3次。隨后將細菌重懸在上述緩沖液中至OD660 nm=0.5。加入羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)使終濃度為10 μmol·L-1，再分別加入甘草酸至所需濃度，陽性對照加入多黏菌素B至終濃度為128 μg·mL-1，空白對照加入等量生理鹽水，最后加入頭孢噻吩使終濃度為32 μg·mL-1。通過分光光度計測量490 nm處的吸光度值，檢測頭孢噻吩在20 min內的水解情況[13]。

1.7 內膜質子梯度影響試驗

試驗分為3個組，分別為甘草酸 3.125 mg·mL-1組、甘草酸6.25 mg·mL-1組和空白對照組。將E320菌株培養至OD660 nm約0.5(37 ℃ 200 r·min-1)，在室溫下，4 400 r·min-1離心10 min，棄上清，重懸于50 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)中，洗滌2次。隨后將細菌重懸在含有2.5 mmol·L-1K-EDTA 和1%乙醇緩沖液中，并在37 ℃孵育20 min，再次在室溫下4 400 r min-1離心10 min，棄上清，并重懸在上述緩沖液中至OD660 nm=1。加入甘草酸至所需濃度，空白對照組加入等量生理鹽水，轉移至比色皿中，熒光分光光度計中測量熒光信號，調節激發波長為488 mm，發射波長為613 mm，激發狹縫寬度為10 nm，發射狹縫寬度為5 nm。首先記錄細胞懸液的熒光強度60 s，然后加入DiOC2(3)至終濃度為10 μmol·L-1，在熒光強度達到平穩后，加入25 mmol·L-1葡萄糖，待熒光強度穩定后，再加入CCCP，觀察其熒光強度變化[13]。

1.8 qPCR檢測甘草酸與頭孢噻肟鈉對AcrB正負向調控基因表達的影響

將菌株E320培養至OD600 nm約0.5(37 ℃ 180 r·min-1)，稀釋細菌懸液至1×106CFU·mL-1，取10 mL細菌懸液，分別進行以下處理：甘草酸組甘草酸終濃度為3.125 mg·mL-1；頭孢噻肟鈉組頭孢噻肟鈉終濃度為64 μg·mL-1；甘草酸與頭孢噻肟鈉聯合應用組甘草酸的終濃度為3.125 mg·mL-1，頭孢噻肟鈉的終濃度為64 μg·mL-1；空白對照組加入等量生理鹽水。各組于37 ℃ 200 r·min-1振搖培養12 h后，使用RNAisoPlus提取菌體RNA，OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0為合格樣品。取1 μg總RNA使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒制備cDNA。16S RNA及其他AcrB調控基因引物由生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 RFQ-PCR primers

實時熒光定量PCR反應體系：Nuclease-Free H2O 7 μL，加入qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，使終濃度為0.5 μmol·L-1，最后加入2 μL cDNA混勻。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火60 s，循環45次；測定熔解曲線[14]。結果統計用2-ΔΔCt法[15]。

2 結 果

2.1 AcrB外排泵抑制劑的虛擬篩選

共篩選得到結合能低于-46.046 kJ·mol-1的中藥單體14個，其中，以紅杉黃酮(seguoiaflavone)結合能最高，為-50.232 kJ·mol-1，其次為豆甾醇(stigmasterol )結合能-48.976 2 kJ·mol-1、栝樓萜二醇-3-苯甲酸酯(karounidiol3-benzoate)結合能-48.557 6 kJ·mol-1、甘草酸(glycyrrhizin)結合能-47.720 4 kJ·mol-1，但考慮中藥單體成分的溶解性、應用廣泛性、價格等因素，選取甘草酸(glycyrrhizin)進行后續的研究。部分結果見表2。

表2 AutoDock Vina虛擬篩選的部分中藥成分評分結果Table 2 Scoring results of some Chinese herbal medicinal ingredients screened virtually by AutoDock Vina

2.2 甘草酸配體與AcrB蛋白作用力分析

本試驗對甘草酸(圖1)與AcrB蛋白進行了分子間作用力分析，甘草酸與AcrB蛋白多個氨基酸殘基形成了疏水作用力，并且還與對接部位形成多個氫鍵。其結合作用力為47.720 4 kJ·mol-1，主要作用位點為Gly126、Gln125、Ser48、Tyr49、Thr85、Thr87、Phe178、Phe615、Phe628、Ile277、Val612，與Gly126、Gln125、Ser48、Tyr49、Thr85、Thr87形成氫鍵，與Phe628、Phe615、Phe178、Val612、Ile277形成疏水作用力(圖2)。

圖1 甘草酸結構示意圖Fig.1 Structure of glycyrrhizic acid

2.3 甘草酸和抗生素的聯合抑菌試驗

通過微量肉湯二倍稀釋法測得甘草酸對大腸桿菌E320與大腸桿菌ATCC25922的MIC均>25 mg·mL-1，磷霉素鈉、氯霉素、頭孢噻肟鈉對大腸桿菌E320的MIC分別為512、512和1 024 μg·mL-1。磷霉素鈉、氯霉素、頭孢噻肟鈉對大腸桿菌ATCC25922的MIC分別為32、8和2 μg·mL-1。

聯合抑菌試驗結果顯示甘草酸使磷霉素鈉對大腸桿菌E320的MIC降為原來的1/8(64/512)；甘草酸使氯霉素對大腸桿菌E320的MIC降為原來的1/2(256/512)；甘草酸使頭孢噻肟鈉對大腸桿菌E320的MIC降為原來的1/8(128/1 024)，詳情見表3。

表3 甘草酸和抗生素聯合抑菌試驗Table 3 Combined drugs susceptibility test of glycyrrhizic acid and antibiotics

2.4 尼羅紅外排試驗

本試驗中，甘草酸6.25 mg·mL-1組熒光強度(13.7 au)與25 mg·L-1PAβN組(13.9 au)均高于3.125 mg·mL-1組(12.8 au)，并且均高于空白對照組(12.4 au)，加入葡萄糖后，甘草酸6.25 mg·mL-1組熒光強度(11.6 au)下降明顯小于3.125 mg·mL-1組(10.6 au)與25 mg·L-1PAβN組(11.0 au)，且下降后熒光強度仍保持原有趨勢，即高于空白對照組(10.3 au)(圖3)。

2.5 外膜滲透穩定性測定

試驗結果顯示，甘草酸3.125、6.25 mg·mL-1組與空白對照組在20 min內熒光強度趨于穩定，均無明顯上升(圖4)。

2.6 內膜質子梯度影響試驗

試驗結果顯示，甘草酸3.125 mg·mL-1組與空白對照組相比變化很小，但甘草酸濃度增加為6.25 mg·mL-1時與空白對照相比變化較大(圖5)。

2.7 qPCR檢測甘草酸與頭孢噻肟鈉對AcrB正負調控基因表達量的影響

AcrAB-TolC外排泵的調控基因包括AcrR、AcrS、Fis、MarA、MarR、MppA、RamA、Rob、RpoS、SdiA、SoxR、SoxS等，結果顯示，甘草酸可顯著誘導AcrS、MppA、RamA、RpoS、SdiA、SoxR的mRNA下調，頭孢噻肟鈉可顯著誘導AcrB、AcrR、Fis、MarR、Rob、SdiAmRNA表達上調，甘草酸聯合頭孢噻肟鈉使用可顯著促進AcrR、Fis、MarR、Rob、RamAmRNA的表達和抑制AcrB、MarAmRNA的表達(圖6)。

a.甘草酸與AcrB蛋白結合2D示意圖(綠色圓形.氫鍵的蛋白殘基；綠色虛線.氫鍵；黑色字體.鍵長；紫色、粉色圓形.疏水作用力殘基)；b.甘草酸與AcrB蛋白結合3D示意圖(粗棒.配體；細棒.蛋白殘基；綠色虛線.氫鍵；蛋白表面的顏色.疏水作用力；左下角圖例.作用力)a.2D diagram of glycyrrhizic acid binding with AcrB protein (Green round.Hydrogen-bonded protein residue;Green dotted line.Hydrogen bond;Black font.Bond length;Purple or pink round.Hydrophobic residues);b.3D diagram of glycyrrhizic acid binding with AcrB protein (Thick rod.Ligand;Thin rod.Protein residue;Green dotted line.Hydrogen bond;Protein surface color.Hydrophobic force;Legend at bottom left.Interaction)圖2 甘草酸與AcrB蛋白作用力分析Fig.2 Analysis of interaction between glycyrrhizic acid and AcrB protein

1.空白對照組；2.甘草酸3.125 mg·mL-1組；3.甘草酸6.25 mg·mL-1組；4.25 mg·L-1 PAβN組1.Blank control group;2.3.125 mg·mL-1 glycyrrhizic acid group;3.6.25 mg·mL-1 glycyrrhizic acid group;4.25 mg·L-1 PAβN group圖3 甘草酸對大腸桿菌E320尼羅紅外排的影響Fig.3 Effect of glycyrrhizic acid on Nile red efflux of E.coli E320

1.空白對照組；2.陽性對照組；3.甘草酸3.125 mg·mL-1組；4.甘草酸6.25 mg·mL-1組1.Blank control group;2.Positive control group;3.3.125 mg·mL-1 glycyrrhizic acid group;4.6.25 mg·mL-1 glycyrrhizic acid group圖4 甘草酸對大腸桿菌ATCC35218外膜滲透性的影響Fig.4 Effect of glycyrrhizic acid on outer membrane permeability of E.coli ATCC35218

1.空白對照組；2.甘草酸3.125 mg·mL-1組；3.甘草酸6.25 mg·mL-1組1.Blank control group;2.3.125 mg·mL-1 glycyrrhizic acid group;3.6.25 mg·mL-1 glycyrrhizic acid group圖5 甘草酸對大腸桿菌E320內膜質子濃度的影響Fig.5 Effect of glycyrrhizic acid on proton gradient across the inner membrane of E.coli E320

3 討 論

計算機輔助藥物設計(CADD)以計算模擬的方式使試驗中效率低下的問題得以有效解決[16]。Autodock Vina由Scripps研究所研發，是AutoDock的第2代分子對接軟件，Vina分子對接的精度較AutoDock更高。并且Vina操作簡易，可進行并行計算，對接速度較AutoDock具有很大優勢[17]。本研究通過Autodock Vina軟件對中藥單體與AcrB蛋白進行分子對接模擬，結果顯示，多種中藥單體與AcrB蛋白受體有好的結合作用。已知AcrB抑制劑PAβN主要與AcrB的Phe136和Phe628形成疏水作用[18]。甘草酸與PAβN具有相同的結合位點，且與其他已知的AcrB抑制劑(MBX2319[9]和D13-9001[19])重疊部分為Phe178、Phe615、Phe628，提示這些位點可能為AcrB蛋白抑制劑作用的主要位點。

聯合抑菌試驗顯示甘草酸與氯霉素有相加作用，與頭孢噻肟鈉、磷霉素鈉有協同作用，其中，氯霉素與頭孢噻肟鈉剛好屬于大腸桿菌AcrAB-TolC外排泵底物[20-21]，一定程度上提示甘草酸降低頭孢噻肟鈉的耐藥性是外排泵活性降低引起的。

尼羅紅是一種親脂性染料，在水溶性介質中顯示極弱的熒光，可以忽略，但是在非極性環境(如細胞膜中)，其熒光水平將迅速增強。PAβN是一種已知的作用于革蘭陰性菌(如大腸桿菌AcrB)主要的多藥耐藥外排泵抑制劑[22]，本試驗中結果顯示，甘草酸可以抑制大腸桿菌E320的外排活性，且與PAβN具有相似的作用，并在加入葡萄糖激活外排泵后，仍具有一定抑制作用，表明甘草酸能夠抑制大腸桿菌外排泵的活性，從而阻止頭孢噻肟鈉外排，進而殺死細菌，很好地解釋了甘草酸降低頭孢噻肟鈉MIC的作用機制。

Control.空白對照組；Gly.甘草酸組；CTX.頭孢噻肟組；CTX+Gly.頭孢噻肟與甘草酸聯用組。小寫字母a～d.不同字母表示差異顯著(P<0.05)Control.Blank control group;Gly.Glycyrrhizic acid;CTX.Cefotaxime sodium;CTX+Gly.Combination of cefotaxime sodium and glycyrrhizic acid.The lowercase letters a-d.Different letters indicated significant differences (P<0.05)圖6 甘草酸對AcrAB-TolC外排泵調控基因相對表達量的影響Fig.6 Effect of glycyrrhizic acid on relative expression of regulatory genes of AcrAB-TolC efflux pump

革蘭陰性菌的細胞外膜發揮著滲透屏障的作用，有些化合物可以通過破壞陰性菌的外膜滲透穩定性導致抗菌藥物透過外膜屏障，進而增加細菌內該藥物濃度的累積。頭孢噻吩易被β-內酰胺酶水解，水解產物能夠被分光光度計在490 nm處檢測到。頭孢噻吩的水解速率受其擴散透過細胞外膜的速率限制：頭孢噻吩透過外膜的速率越快，其水解速率越快，水解產物的熒光強度就越高。因此頭孢噻吩水解產物的熒光強度可以反映出外膜滲透性的強弱。本試驗中加入甘草酸未對外膜滲透性產生影響，表明甘草酸能夠增加細菌體內頭孢噻肟鈉的濃度不是由于外膜滲透性的改變引起的。

AcrB蛋白在外排轉運底物時需要消耗能量，這種能量是以質子動力作為能源[23]。有些化合物能夠阻礙AcrB外排泵的能量來源，通過破壞質子濃度梯度，使外排泵失去能量供應，進而瓦解其外排作用。對內膜質子梯度影響試驗主要通過DioC2(3)熒光檢測法來測定。本試驗結果表明，濃度為3.125 mg·mL-1的甘草酸不會阻礙AcrB外排泵的能量來源。

AcrB蛋白的表達受多個調控因子的影響，其中主要的正向調控子有MarA、SoxS、RamA、Rob、SdiA，MarA基因編碼MarA調控子與SoxS基因編碼的SoxS調控子可以激活AcrAB的表達[24]；SoxR基因編碼的SoxR蛋白能夠激發SoxS基因的轉錄。SoxS基因編碼的SoxS蛋白屬于全局調控蛋白，它可以激活AcrAB-TolC的表達從而使細菌對抗生素的敏感性降低[25]；RamA基因編碼的RamA調控子過表達可能通過誘導AcrAB-TolC外排泵的表達導致細菌出現多重耐藥性[26]；Rob基因所編碼的Rob調控子與MarA、SoxS屬于同一轉錄調控子家族，過表達會增加多種抗生素的低水平耐藥性[27]；SdiA基因所編碼的SdiA調控子過量表達可激活AcrAB基因的表達[28]。主要的負向調控子有AcrR、MarR，AcrR基因編碼的AcrR調控子能與AcrAB基因結合，抑制AcrAB蛋白的表達[29]；MarR基因編碼的MarR調控子能夠抑制正向調控子MarA基因的轉錄激活[30]。當單個或多個Acr基因失活時，所有RND外排泵基因的表達均增加，提示存在一種激活同源外排泵基因轉錄的反饋機制[31]。Zhang等[32]發現轉錄調節基因RamA在AcrA或AcrB單一缺失突變體中表達顯著增加，這一發現也從某種程度上證明了該反饋機制的存在。因此甘草酸聯合頭孢噻肟鈉導致RamA、Rob、SdiA過表達很可能也是由于這一反饋機制的存在，甘草酸與AcrB蛋白結合使正常的AcrB蛋白失活，從而促進其表達。而AcrB的表達降低可能與負向調控子AcrR、MarR過表達相關。

甘草酸是甘草中主要的活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗氧化等生物學活性[33-34]，又稱甘草甜素，作為甜味劑廣泛用于各類食品。甘草為豆科植物的干燥根和根莖，是一種補益中草藥，在臨床上被廣泛應用，有“十方九草”之稱。

一個良好的AcrB抑制劑應該具備4個條件：1)對AcrB過表達菌株能增強抗生素的抗菌活性；2)對AcrB底物尼羅紅具有外排抑制活性；3)不會破壞細菌外膜的滲透性；4)不會影響細菌的內膜質子梯度。通過本試驗發現甘草酸有望成為1種新的AcrB外排泵抑制劑，對治療耐藥菌引發的疾病具有重要意義。

4 結 論

甘草酸可以抑制多重耐藥大腸桿菌E320耐藥性，其主要機制：甘草酸結合大腸桿菌多藥外排泵轉運蛋白AcrB，進而抑制其外排活性，不影響外膜通透性和內膜質子梯度；誘導負向調控子AcrR、MarR過表達，來抑制AcrB的表達，造成抗生素在菌體內蓄積從而提高抗生素的殺菌作用。