山羊支原體肺炎的CT影像分析

姜 敏，姚大偉，田 睿，毛 立，史超穎，李文良，張紋紋，李基棕，楊蕾蕾，孫 敏，楊德吉*，劉茂軍*

(1.南京農業大學動物醫學院，南京 210095；2.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京 210019；3.南京艾貝爾動物醫學中心，南京 210046)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)可引起綿羊和山羊間質性肺炎，主要表現為咳嗽、流鼻涕、發熱、漸進性消廋[1-2]。該病一年四季均可發生，以秋冬季為主，應激等其他誘因使羊免疫力下降，Mo可趁機感染機體[3]，目前，該病已經成為嚴重危害全球養羊業的重要疾病之一。臨床上許多疾病的臨床癥狀及病理表現都與羊支原體肺炎相似，對于該病的診斷主要依據臨床癥狀和分子生物學及免疫學的檢測[4]，但是這些診斷方法耗時較長，而且對于判斷病程轉歸、指導臨床治療的價值有限。計算機斷層掃描(computed tomography，CT)被認為是評估人肺部疾病的金標準[5]，有較高的密度分辨力，可以更好地顯示病變的位置、大小、范圍及性質，另外更有利于判斷病程的轉歸，在早期發現、診斷過程及治療都存在著重大的意義。近年來，CT在小動物肺部疾病的診斷中越來越廣泛[6-7]，國外早在2005、2007年就有了關于CT在反芻動物肺部疾病中應用的相關報道[8-9]。迄今為止，國內鮮有關于羊肺部疾病的CT影像診斷研究。本研究人工感染山羊肺炎支原體，誘發山羊支原體肺炎，結合病理解剖學和組織病理學變化研究山羊支原體肺炎的CT影像學特征，以期為臨床上羊肺部疾病的影像學診斷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 支原體

綿羊肺炎支原體IK3-3株(CVCC380)，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器設備和試劑

聯影醫療uCT510立體等像素16層螺旋CT掃描儀(聯影)，速眠新、蘇醒靈(拜特醫藥)，異氟烷(河北一品制藥)，綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒(中國科學院蘭州獸醫所)，KM2液體培養基：MEM培養基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)55 mL，1.7%水解乳蛋白Hank’s緩沖液35 mL，25%酵母浸液2 mL，健康馬血清10 mL，1%醋酸鉈溶液1 mL，青霉素200 IU·mL-1，0.4%酚紅0.18 mL，調整pH至7.4～7.8。

1.3 試驗動物

20只山羊購自江蘇句容某養殖場，體重在30～40 kg，臨床及影像學檢查均無異常，經綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒檢測陰性。

1.4 綿羊肺炎支原體的制備

將綿羊肺炎支原體IK3-3株按1∶10比例接種KM2液體培養基中，37 ℃靜置培養，待培養物變黃后，傳代擴大培養，待培養物變黃后，按顏色變化單位(cell culture unit,CCU)測定支原體含量，收獲備用。

1.5 人工感染綿羊肺炎支原體

20只羊隨機分為兩組，對照組C(n=5)和試驗組E(n=15)。試驗組每只羊氣管內注射接種5 mL綿羊肺炎支原體IK3-3株(107CCU·mL-1)，對照組接種5 mL的無菌生理鹽水。接種完畢后肌注與速眠新等劑量蘇醒靈使羊蘇醒。兩組羊隔離飼養，每日早上09:00觀察兩組羊臨床癥狀，測量直腸體溫。

1.6 CT檢查

對照組與試驗組分別于人工接種前和接種后第7、14、21、28天進行CT掃查。檢查前所有羊禁食24 h，禁水2 h。肌內注射速眠新(0.1 mg·kg-1)進行誘導麻醉，采用面罩進行異氟烷維持麻醉，于掃描床上俯臥位保定，頭朝向掃描機架，進床掃描。使用聯影醫療uCT510立體等像素16層螺旋CT掃描儀進行胸部掃查，掃查參數為電壓140 kV，電流20 mA，螺旋掃描方式，層厚1.2 mm，層距0.6 mm，矩陣512 × 512。檢查結束后，肌注與速眠新等劑量蘇醒靈使羊蘇醒。應用HOROS軟件對掃描獲得的CT影像進行讀片、分析。圖像重建肺窗(WW 1400，窗位WL- 500)，縱膈窗(WW 350，窗位WL 40)，

1.7 病理學檢查

感染后第29天切斷頸動脈處死，剖檢觀察病理解剖學變化。選擇病變明顯的肺葉，手術刀切取小塊病變和健康交界處的肺組織，置于4%甲醛溶液進行固定，制備常規石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.8 病料中支原體分離、鑒定

羊剖殺后，參考孫喜安[10]的方法，分離培養并鑒定支原體。取肺病健交接部位，至少選擇3個取樣點，在研缽中加入2 mL KM2培養基；將病料剪碎研磨，過濾，將濾液按1∶5比例接種培養基，37 ℃ 培養3～4 d。分離培養物用細菌基因提取試劑盒提總基因組DNA。根據HSP70基因設計PCR鑒定引物MoHSP70-F：5′-ATGAAAGGAAAACATAATATGGC-3′，Mo HSP70-R：5′-TTAGTT- TTGTTTGATTTCAGCAT- 3′，目的片段1 815 bp。PCR反應體系：2 × T5 Super PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，補水至20 μL。PCR條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，30循環，72 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結 果

2.1 肺炎支原體感染后臨床癥狀觀察

對照組羊感染后未見咳嗽、噴嚏及眼鼻分泌物等臨床癥狀。試驗組羊接種綿羊肺炎支原體后，按照臨床癥狀可分為重癥、中癥和輕癥。重癥羊4只，在感染后第3～4天普遍出現食欲減退的表現，體溫升高(41～42 ℃)，感染后7 d出現噴嚏及咳嗽等癥狀，第14天出現打噴嚏、咳嗽，眼鼻分泌物增多等較為嚴重的呼吸道癥狀，并持續到第21天，之后逐漸減輕。中癥羊感染7 d后，體溫一過性升高(40～41 ℃) 之后正常，并有輕微咳嗽、流漿液性鼻液和腹瀉等癥狀，21 d后無異常臨床癥狀。輕癥羊感染后體溫正常或以中低溫為主，偶爾略微升高，僅表現流漿液性鼻液或膿性鼻液。另5只無癥狀，鼻拭子經綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒檢測，判為未感染。

表1 羊支原體肺炎臨床癥狀Table 1 Clinical manifestations of sheep mycoplasma pneumonia

2.2 CT檢查表現

對照組羊CT影像如圖1所示(圖像的左側為身體的右側，上方為身體的背側)。在接種前、感染后第7、14、21、28天對照組CT影像均未發現異常。雙側肺紋理清晰，未見異常密度影，氣管、支氣管通暢，支氣管周圍未見異常密度影。肺門、縱隔未見腫大淋巴結影。雙側胸膜平滑，無增厚，胸膜腔未見積液征。

圖像的左側為身體的右側，上方為身體的背側The left side of the image is the right side of the body,and the top is the back side of the body圖1 對照組羊第7、14、21和28天胸部CT影像Fig.1 CT images of sheep in control group at day 7,14,21 and 28 during the experiment

重癥組羊CT影像如圖2所示，感染初期(第7天)多見各肺葉呈現片狀的磨玻璃密度影(白色箭號)，肺紋理紊亂增粗，部分肺葉出現大片實變影(白色箭頭)；中后期(第14～21天)整體肺野密度增高，支氣管血管周圍間質增厚，出現邊緣模糊的高密度“鞘”狀結構(黑色箭號)；有的羊可見大片炎癥滲出所致的空氣支氣管征(黑色箭頭)；胸膜滲出，表現條帶狀的增厚影(白色三角形)。第28天胸部影像較第21天無明顯變化。

中癥組羊CT影像如圖3所示，感染初期(第7天)整體肺葉密度變化不大，右側中葉支氣管周圍、右側肺葉出現部分小片狀的磨玻璃密度影(白色箭號)。感染中期(第14天)右肺中葉支氣管出現相平行的兩條線狀高密度“軌道征”及“印戒征”(白色箭頭)，提示支氣管壁增厚；雙側后葉前部小葉間間質增厚，呈現網狀/線狀的不透明影(黑色箭號)，右后葉出現平行于胸壁的胸膜下線(黑色箭頭)。感染后期(第21天)病灶基本吸收，肺野密度大體恢復正常。第28天影像已無異常。

輕癥組羊CT影像如圖4所示，感染初期(第7天)可見部分肺葉出現小片狀的磨玻璃密度影(白色箭號)，雙肺后葉出現由于細支氣管擴張導致的“樹芽征”(白色箭頭)，右側后葉后段出現沿著胸壁的線狀紊亂影像(黑色箭號)。感染中期(第14天)磨玻璃密度影和“樹芽征”基本消失，感染第7天掃描所見的右側后葉后段的線狀紊亂影已發展為胸膜下線(黑色箭頭)。感染后期(第21天)影像已無異常。

2.3 CT影像數據分析

羊支原體肺炎CT影像分析結果如表2所示，試驗組中10只羊肺部出現異常影像，其中，單側肺葉病變3只，雙側肺葉病變7只，右前葉病變10只，右中葉病變5只，右后葉病變8只，左前葉病變5只，左后葉病變6只，副葉病變4只。主要以磨玻璃影為主，多表現為間質性肺炎，好發于右前葉，重癥組多見支氣管壁增厚，空氣支氣管征和網格狀影。

表2 羊支原體肺炎CT影像數據分析Table 2 CT data analysis of sheep mycoplasma pneumonia

2.4 病理剖檢

試驗組羊剖檢如圖5所見。打開胸腔可見部分肺與胸膜發生粘連(白色三角形)。肺有不同程度的粉色肉變(黑色箭號)和肝變(白色箭號)，肺與胸壁發生粘連。局部有明顯的結節(白色箭頭)出血點和出血斑，病變區域突出于肺表面，質地堅硬，用手觸摸有粗糙感，顏色呈暗紅色或粉紅色。肺間質明顯增寬，表面呈大理石紋路病變(黑色箭頭)，病變區域和健康區域有明顯界限。

2.5 病理組織學檢查

試驗組羊病理組織學檢查結果如圖6所示。可見不同程度的支氣管肺炎及間質性肺炎，與CT影像表現一致。細支氣管黏膜上皮增生，周圍巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，管腔內有漿液性滲出，混有大量的中性粒細胞、巨噬細胞和脫落的上皮細胞(圖6A)；肺局部見膿腫病灶(圖6B)，肺泡腔及間質內見大量壞死的中性粒細胞；肺泡結構部分破壞(圖6C)；肺泡壁與間隔有中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤(圖6D)。小血管周圍淋巴細胞浸潤，毛細血管充血、淤血。

白色箭號.磨玻璃密度影；黑色箭號.“鞘”狀影；白色箭頭.實變影；黑色箭頭.空氣支氣管征；白色三角形.胸膜增厚影White arrow.Ground-glass opacity；Black arrow.“Sheath”shape；White arrowhead.Consolidation shadows；Black arrowhead.Air bronchogram；White triangle.Thickening of the pleura圖2 支原體肺炎重癥組羊第7、14、21和28天胸部CT影像Fig.2 CT images of sheep mycoplasma pneumonia in severe group at day 7,14,21 and 28 during the experiment

2.6 支原體分離、鑒定

從試驗組感染成功羊的肺部采集的病料，經過培養及PCR檢測，擴增到1 815 bp目的片段(圖7)，與預期理論大小一致，說明試驗組羊感染了綿羊肺炎支原體。

白色箭號.磨玻璃密度影；黑色箭號.線狀影；白色箭頭.樹芽征；黑色箭頭.胸膜下線White arrow.Ground-glass opacity；Black arrow.Linear disorder；White arrowhead.Tree-in-bud；Black arrowhead.Subpleural line圖4 支原體肺炎輕癥組羊第7、14天CT影像Fig.4 CT images of sheep mycoplasma pneumonia in mild group at day 7,14 during the experiment

3 討 論

支原體感染動物機體后常引起慢性或潛伏感染，造成慢性消耗性疾病，并且常引起其他繼發性疾病，發病率和死亡率增加[11-12]。Mo感染后細胞因子能夠激活內皮細胞和粒細胞，導致炎癥的發生[13]。在臨床上表現為非典型肺炎癥狀，危害嚴重。CT具有較高的密度分辨力，對病變的部位、形態、密度、臨近支氣管、血管束及胸膜、縱隔狀況均有較好的顯現，是診斷肺部疾病的最佳影像檢查方法。可以發現X線片難以發現的病變影像和肺炎早期的影像變化，有助于與其他疾病進行鑒別診斷[14]。

本研究人工感染綿羊肺炎支原體，通過臨床癥狀、病理學變化、病原學檢測確定支原體肺炎造模成功。由于機體免疫力不同，感染的病羊表現出不同程度的臨床癥狀。病羊剖檢可見氣管有大量的黏液滲出，多見雙側肺葉發生病變，好發于右前葉。肺有明顯的出血點和出血斑，不同程度的肉變，能明顯看到健康和病變的交界處，切面呈大理石樣。病變肺組織病理檢查可見肺間質增寬，支氣管上皮細胞增生，支氣管內炎性滲出，血管和細支氣管周圍也存在大量炎性細胞浸潤[15]。

本研究對成功誘發支原體肺炎羊進行CT掃描，由獲得影像可知羊支原體肺炎影像主要以間質性肺炎伴發支氣管肺炎為主。CT影像上以片狀的磨玻璃密度影為主要特征，同時也會出現小葉間間隔增厚的網格狀影像，符合間質性肺炎的影像表現，病理組織學檢查也顯示間質增厚，符合間質性肺炎的病理表現。支氣管黏膜增厚、出現雙軌征是支氣管肺炎的主要CT影像表現，病理上表現為支氣管黏膜增厚，管腔內大量的炎性滲出。CT影像上的實變影，與病理解剖上表現的肉變和肝變的變化一致。

白色三角形.粘連;黑色箭號.肉變;白色箭號.肝變；黑色箭頭.大理石紋路病變；白色箭頭.結節White triangle.Adhesion；Black arrow.Carnification；White arrow.Hepatization；Black arrowhead.Marbling lesions；White arrowhead.Nodule圖5 肺病理變化Fig.5 Pathological anatomy of lung

A～C.40×;D.100×。a.細支氣管；b.肺泡；c.滲出物；d.肺泡隔增厚；e.支氣管周圍炎性細胞浸潤；f.出血；g.中性粒細胞；h.巨噬細胞；i.單核細胞；j.淋巴細胞A-C.40×;D.100×.a.Bronchiole；b.Alveoli；c.Transudation；d.Thickening of alveolar septa；e.Inflammatory cells infiltration around the bronchi；f.Hemorrhage；g.Neutrophilic leukocytes；h.Macrophagocyte；i.Monocyte；j.Lymphocyte圖6 試驗組羊肺組織病理學檢查(HE染色)Fig.6 Histopathological examination of lung in experimental group(HE staining)

M.DNA 相對分子質量標準;1.IK3-3株；2.空白對照；3.分離株-1；4.分離株-2M.DNA marker；1.IK3-3 strain；2.Blank control；3.Isolate strain-1；4.Isolate strain-2圖7 Mo HSP70 PCR鑒定結果Fig.7 PCR identification results of Mo HSP70

隨著支原體肺炎病程的發展，CT影像表現也在不斷的變化。重癥組羊初期以磨玻璃密度影為主，肺紋理增粗，部分肺葉實變。隨著病情的發展，肺野整體的密度升高，直至試驗結束后也無明顯的變化，這些均與臨床表現相符。中癥組病情相對重癥組輕，CT影像上也沒有表現出大面積的實變影，且在21 d內影像表現大部分消失。輕癥組僅出現小片狀的磨玻璃密度影，且第14 天后已經無明顯的影像表現。

4 結 論

山羊支原體肺炎多見雙側肺葉病變，好發于右前葉，以間質性肺炎伴發支氣管肺炎為主，胸部CT影像主要表現為片狀磨玻璃密度影，網格狀陰影，其中重癥羊多見空氣支氣管征，個別羊見胸膜增厚影。支原體肺炎的影像表現與臨床癥狀、病程發展一致，影像上的表現與病理解剖學、病理組織學變化也具有一致性，說明CT可以準確地評估羊支原體肺炎的發展，對羊支原體肺炎的診斷具有重要的參考價值。