枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

金如昌，孟恒君，濮夢華，胡昊

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽馬鞍山243100）

煙酸（Nicotinic Acid，NA）也稱作維生素B3，是一種可溶性維生素，人體必需的13種維生素之一，廣泛存在于動物內臟、牛奶、雞蛋以及新鮮蔬菜中。煙酸可用于飼料添加劑，以提高動物對飼料中蛋白質的利用率，促進動物的生長發(fā)育。此外，煙酸還是一種廣泛的醫(yī)藥中間體，可以作為抗癩皮病和抗狗黑舌癥的重要因子。

目前，合成煙酸的方法主要有氨氧化法、空氣直接氧化法、電解氧化法、吡啶羥基化法。化學方法生產煙酸需要高溫、高壓等反應條件，環(huán)境污染大，生產效率低。隨著生物工程技術的高速發(fā)展和日益嚴峻的環(huán)境要求，利用生物法合成煙酸符合目前綠色化學發(fā)展的趨勢，通過將微生物發(fā)酵直接生產煙酸已成為最主要的方法，目前生產所用菌株主要有馬紅球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌。本公司研發(fā)部門前期通過紫外誘變和化學誘變篩選出枯草芽孢桿菌N-17，該菌株可以產生煙酰胺酶，經過搖瓶實驗，證明該酶能夠將煙酰胺轉變?yōu)闊熕?，轉化率達97.8%～98.4%。

本研究對N-17菌株進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，通過考查不同發(fā)酵溫度、pH值、添加不同碳氮源、不同金屬離子等，確定枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶發(fā)酵的最佳條件，為枯草芽孢桿菌后續(xù)產煙酸工業(yè)化生產條件奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

菌株來源：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），保藏編號為CICC10071，安徽瑞邦生物科技有限公司；所有試劑市購。

培養(yǎng)基配方：

活化斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，KHPO0.4 g/L，MgSO·7HO 0.4 g/L，NaCl 10 g/L，Cu-SO·5HO 0.06 g/L，F(xiàn)eCl0.18 g/L，瓊脂2 g/L，pH 6.8。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，KHPO0.4 g/L，MgSO·7HO 0.4 g/L，NaCl 10 g/L，CuSO·5HO 0.06 g/L，F(xiàn)eCl0.18 g/L，pH 6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母粉10 g/L，KHPO0.4 g/L，MgSO·7HO 0.4 g/L，NaCl 10 g/L，CuSO·5HO 0.06 g/L，F(xiàn)eCl0.18 g/L，pH 6.8。

主要儀器：UV-1800紫外可見分光光度計；BCM-1300A潔凈工作臺；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.2 實驗方法

斜面活化培養(yǎng)：28℃培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)：活化的菌株接種于20 mL種子培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，種子液OD600為10～20，酶活10 U/mL以上時，按5%的接種量接種于100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3天，測定煙酰胺酶酶活。

酶活單位定義：28℃、一分鐘內能催化煙酰胺生成1.0微摩爾煙酸所需的酶量為一個酶活單位（U）。

酶活檢測方法：預先加入定量的煙酰胺和磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，加入固定量的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，反應10 min后再加入乙腈進行滅活，通過液相色譜檢測產生的煙酸含量，判定酶活大小。

發(fā)酵條件的優(yōu)化：分別采用不同起始發(fā)酵溫度、pH值，添加不同碳氮源、不同金屬離子經培養(yǎng)后測定發(fā)酵液酶活，找出最佳培養(yǎng)條件。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的影響

碳源可以提供微生物生長發(fā)育所必須的能量，是體內代謝物質和貯藏物質等必不可少的原料，本實驗采用不同濃度的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘油作為碳源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3天。比較不同碳源及使用的不同濃度下，葡萄糖在濃度為1.2%時酶活達到最大，達到了14.30 U/mL，而葡糖糖濃度越來越大時，酶活也在逐步下降，據(jù)文獻報道，這可能與葡萄糖濃度增加而導致菌株代謝的增加，引起發(fā)酵液中pH值過低，導致酶活降低。從單因素實驗來看，最后確定的最佳碳源為葡萄糖，最適濃度1.2%。見圖1。

圖1 不同碳源及其濃度對酶活的影響

2.2 不同氮源對枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的影響

為了研究氮源對枯草芽孢桿菌產煙酸的影響，選擇了幾種有利于腈水解酶的有機氮源和無機氮源——酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨。由圖2可知，有機氮源對腈水解酶酶活的影響明顯優(yōu)于無機氮源，其中酵母粉在濃度為0.6%時，酶活達到最大值，而在酵母粉濃度超過0.6%時，酶活力開始降低，這可能是由于酵母粉濃度的增加，導致菌株生長過剩，提前進入衰老期，從而影響酶活。最終確定最適氮源為酵母粉，濃度為0.6%。

圖2 不同氮源及其濃度對酶活的影響

2.3 不同金屬離子對枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的影響

在微生物生長和繁殖過程中，需要一些金屬離子參與其生理反應，來激活酶的活性，如鎂、鋅、鈷和錳等。通過添加不同濃度的金屬離子，測定發(fā)酵液中的酶活，與對照相比，發(fā)現(xiàn)Mg、Fe對酶活具有促進作用，而Mn、Co對酶活具有抑制作用。添加0.02%濃度的Mg，酶活達到最大值，之后酶活開始下降，所以確定發(fā)酵最適的金屬離子為Mg，最適濃度0.02%。見圖3。

圖3 不同金屬離子及其濃度對酶活的影響

2.4 不同發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的影響

為了明確不同溫度對產煙酸發(fā)酵條件的影響，將發(fā)酵溫度控制在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃。如圖4所示，28℃酶活達到最大值，之后酶活開始降低，所以最適合的發(fā)酵溫度為28℃。

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)溫度對酶活的影響

2.5 不同起始pH對枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對微生物的生命活動以及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質具有很大的影響。設置培養(yǎng)基起始pH為5～10，測定發(fā)酵液酶活。由圖5可知，枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的最適pH是7。隨著pH的升高，酶活也逐漸降低，但是下降程度遠低于酸性環(huán)境條件下，說明在中性或者偏堿性的環(huán)境條件下，更有利于該菌產煙酰胺酶。

圖5 起始pH對酶活的影響

2.6 己內酰胺對枯草芽孢桿菌產煙酰胺酶的影響

己內酰胺可以作為誘導劑來影響酰胺酶的活性。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入不同濃度的己內酰胺，測定不同條件下的酰胺酶酶活性，判斷最佳的己內酰胺濃度。由圖6可知，當濃度達到0.2%時，酶活力達到最高，之后隨著濃度的升高，酶活力降低，說明己內酰胺濃度過高會對細胞產生一定的毒害作用，所以確定的最佳己內酰胺濃度為0.2%。

圖6 己內酰胺濃度對酶活的影響

3 結論

本實驗對已篩選出的菌株枯草芽孢桿菌N-17進行發(fā)酵條件優(yōu)化，利用單因素實驗方法，對煙酰胺酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明，該菌株在溫度28℃，起始pH值7.0，己內酰胺濃度為0.2%，葡萄糖1.2%，酵母粉0.6%，Mg0.02%，產煙酰胺酶活性最大，酶活比之前提升了213.8%。本發(fā)酵工藝為后續(xù)發(fā)酵放大以及工業(yè)化生產煙酸提供了較好的指導作用。