基于微波水解-離子色譜的香菇多糖組成指紋圖譜研究

趙秀婷，張 欣，付 萌，李進偉，朱 松，范柳萍

（1.無限極（中國）有限公司，江門 529100；2.江南大學 食品學院，無錫 214122）

多糖是由 10個或以上單糖通過縮合而形成的鏈狀結構物質，在動植物和微生物中廣泛分布，對維持正常生命活動至關重要[1-2]。而多糖中單糖組成分析是研究多糖的結構性質及對其進行質量控制的重要內容。

目前常用的多糖水解方法是加熱酸水解法，加熱方式常采用烘箱加熱，該方法耗時長、能耗大，且受熱不均勻，導致水解樣品重復性很差，遠遠不能滿足研究的需求。而微波水解是將樣品、酸置于微波電磁場中，微波頻率使極性分子取向快速變換，分子在來回轉動過程中與周圍分子高速碰撞摩擦，增加總能量，產生高熱[3]。微波水解方法能使樣品受熱均勻，加快水解速度，降低能耗，降低檢測成本[4]。

對水解后的多糖進行單糖組成分析，常用的方法有氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6]等。由于單糖的揮發性低，難氣化，氣相色譜法測單糖時必須對其進行硅烷化或酯化等衍生化處理，操作繁瑣。采用高效液相色譜法檢測單糖時最常用的是示差折光檢測器，但這種檢測器的靈敏度低、基線易受溫度影響產生大的波動、不能進行梯度洗脫[7]，而采用靈敏度較高的紫外檢測器檢測時，則需對單糖進行衍生化反應，操作繁瑣[8]。近年來，高效陰離子交換色譜被廣泛用于糖的檢測，這是由于糖類分子具有高的電化學活潑性，且在強堿溶液中全部或部分電離成陰離子形式[9]，可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離[10]。由于糖在金電極上易發生氧化還原反應產生信號，離子色譜法檢測糖主要使用金電極的脈沖安培檢測器[11]。該檢測器檢測糖非常靈敏，操作簡便，檢測限可以達到pmol/L，而且不需衍生反應和復雜的樣品處理。

本文將微波水解和離子色譜分析相結合，建立一種快速、高效、準確的多糖組成的分析方法。并采用這種方法構建香菇多糖組成的離子色譜指紋圖譜，通過多糖的單糖組成的分析對香菇多糖的生產進行質量監控，彌補現行質量監控上的不足。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉（NaOH）溶液（50%，w/w）：瑞士Fluka公司；三氟乙酸（TFA）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、無水乙醇均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈，色譜純：美國TEDIA公司；巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rham）、氨基葡萄糖（GlcN）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl），果糖（Fru）、核糖（Rib）標準品：美國 sigma-aldrich公司。

1.2 儀器與設備

ICS-5000+離子色譜儀，配有雙泵(DP)模塊、檢測器/色譜(DC)模塊、自動進樣器(AS)模塊、Chromeleon 7.0色譜工作站：美國Thermo Fisher公司；Waters 2695高效液相色譜儀，配有Waters2489紫外檢測器、Empower色譜工作站：美國Waters公司；CEM Mars6高通量密閉微波消解儀，配有消解罐：美國 CEM 公司；Milli-Q Advantage A10超純水機：美國Millipore公司；5424離心機：德國Eppendrof公司；LE204E分析天平：梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇多糖樣品的制備

取10 mL濃縮香菇多糖產品放入50 mL離心管中，加入30 mL無水乙醇，充分搖勻后，在4 000 r/min下離心10 min，除去上清，沉淀用80%乙醇（30 mL）溶解，充分混勻后，在4 000 r/min下離心10 min，除去上清，在60 ℃下烘干，備用。

1.3.2 微波水解香菇多糖條件優化

以三氟乙酸濃度、微波溫度、微波時間、物料比為單因素，進行優化實驗。準確稱取20 mg烘干后的香菇多糖樣品放入微波消解罐中，每次實驗僅改變一個條件，其他條件固定不變。分別將三氟乙酸濃度設置 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L五個水平；微波溫度設置100、110、120、130、140 ℃五個水平；微波時間設置10、20、25、30、35、40 min五個水平；物料比設置5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的三氟乙酸（3.0 mol/L）。設定微波功率1 600 W，微波水解后水解液稀釋1 000倍，進行離子色譜分析。

1.3.3 標準溶液配制

分別準確稱取10 mg的半乳糖、巖藻糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖標準品，用水定容于10 mL容量瓶中，配成1.000 g/L儲備液，于冰箱中保存，使用時將儲備液稀釋至系列混合標準溶液。

1.3.4 離子色譜條件

色譜柱：Thermo CarboPac PA20 (150 mm×3 mm i.d.) 陰離子交換柱，配有保護柱 (30 mm×3 mm)；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL。以0.25 mol/L NaOH和水為流動相進行梯度洗脫，流速：0.5 mL/min，淋洗條件見表1。脈沖安培檢測器采用糖標準四電位波形。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution conditions

1.3.5 離子色譜方法學研究

1.3.5.1 標準曲線、檢出限 精密稱取各單糖標樣適量，用水配置成系列標準溶液，采用以上離子色譜條件分析。以各標液質量濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到各標樣的回歸方程、相關系數和線性范圍。

1.3.5.2 重復性、穩定性研究 平行制備水解多糖樣品溶液6份，采用離子色譜條件分別分析，計算6個樣品中各單糖峰面積的平均值及相對標準偏差（RSD）。

取稀釋至合適濃度的水解多糖樣品，在0、2、4、6、8、12、24 h采用離子色譜分析，計算樣品中各單糖峰面積的平均值及RSD。

1.3.5.3 準確性研究 取已知單糖組成含量的多糖樣品9份，分別加入高、中、低3個濃度的混合單糖標液，微波水解，離子色譜分析，測定其回收率及RSD。

1.4 數據處理

實驗數據均以平均值±標準偏差表示，每個實驗至少重復三次。數據統計使用SPSS 19.0軟件進行One-Way ANOVA分析，以及Tukey’s多重檢驗，P＜0.05被認為數據差異顯著。采用Origin軟件繪制圖形。

2 結果與討論

2.1 微波水解香菇多糖條件優化

2.1.1 三氟乙酸濃度對香菇多糖水解的影響

改變三氟乙酸的濃度，保持其他條件不變。由圖 1A我們能夠發現：當三氟乙酸的濃度小于3.0 mol/L時，水解液中單糖總量與三氟乙酸的濃度呈正相關；當三氟乙酸的濃度為3.0 mol/L時，單糖總量達到最大值；再增加三氟乙酸的濃度，水解液中單糖總量的下降，因此，最佳三氟乙酸反應濃度為3.0 mol/L。

2.1.2 微波溫度對香菇多糖水解的影響

改變微波溫度，保持其他條件不變。由圖1B我們能夠發現：隨著溫度的提高，水解液中單糖總量先增加；當溫度提高到130 ℃以上，單糖總量逐漸下降。同時考慮到過高的溫度造成爬升溫度時時間的延長及成本的提高，選擇微波溫度為130 ℃。

2.1.3 微波時間對香菇多糖水解的影響

改變微波水解時間，保持其他條件不變。由圖 1C我們發現：隨著時間的延長，水解液中單糖總量先增加；當時間達到30 min以上時，單糖總量下降并逐漸趨于平緩，因此，選擇的最佳微波水解時間為30 min。

2.1.4 物料比對香菇多糖水解的影響

考慮到CEM Mars6高通量密閉微波消解儀的使用情況，我們設置了 5、6、7、8、9 mL共 5個三氟乙酸的體積，其他條件均不變，改變物料比。由圖 1D我們能夠發現：隨著三氟乙酸體積的增加，水解液中單糖總量增加；當三氟乙酸的體積高于 7 mL時，單糖總量逐漸下降。因此，最佳三氟乙酸的體積為7 mL。

圖1 三氟乙酸濃度（A）、微波溫度（B）、微波時間（C）和物料比（D）對香菇多糖水解的影響Fig.1 Effects of trifluoroacetic acid concentration (A), microwave temperature (B),microwave time (C) and material ratio (D) on lentinan hydrolysis

經過單因素實驗分析，得到微波水解的最佳使用條件為：三氟乙酸的濃度：3.0 mol/L；微波溫度：130 ℃；微波水解時間：30 min；物料比：20 mg樣品：7 mL三氟乙酸。

2.2 離子色譜條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇

目前用于分離單糖和小分子低聚糖的陰離子交換色譜柱主要有CarboPac PAl、CarboPac PA10和CarboPac PA20三種。通過實驗比較了這3種色譜柱對樣品中可能存在的 7種糖類的分離效果。實驗發現，在色譜柱CarboPac PA1和CarboPac PA10上，甘露糖和木糖不能較好分離，而在CarboPac PA20上可以達到基線分離。這是由于CarboPac PA20色譜柱樹脂基核及覆蓋在樹脂表面的鍵合季胺基團的乳膠比CarboPac PA10小，分析速度快，柱效高，有更大優勢[9]。故本實驗選擇CarboPac PA20柱進行相關測定。

2.2.2 流動相NaOH的濃度對離子效果的影響

在強堿條件下能夠使糖以陰離子的形式存在，高 pH阻礙了糖分子間氫鍵的行程，使糖分子可與固定相相互作用，故改變NaOH濃度，會影響糖分子與固定相之間的作用程度，從而影響保留時間和響應值[12]。保證其他條件不變的情況下，分別考察3.75、5.00和6.25 mmol/L NaOH淋洗液對9種糖的分離效果，結果如圖2。甘露糖和木糖在NaOH濃度為5.00 mmol/L和6.25 mmol/L時不能分離。而各種糖只有在濃度為3.75 mmol/L的NaOH溶液下才能在 20 min的分析時間內達到較好的分離效果。隨后升高 NaOH濃度為200 mmol/L，沖洗掉樣品中在色譜柱上強保留的組份，達到再生色譜柱的目的，保證離子色譜檢測的穩定性。

圖2 不同洗脫條件下各種糖的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of various sugars under different elution conditions

2.2.3 柱溫對離子效果的影響

柱溫是極易影響離子色譜分析法分離的一個重要參數，改變柱溫能夠改變液液傳質速率，導致分離柱的理論塔板高度的變化，從而對樣品的保留時間產生影響，直接影響到分析物質中各組分在色譜柱上保留時間及分離程度[13-14]。本實驗比較不同柱溫（25、30和 35 ℃）下，各種糖的保留程度，特別是難分離物質氨基葡萄糖和半乳糖以及甘露糖和木糖的保留和分離的影響。由圖3可知，在柱溫為25 ℃時，糖的保留時間均延長，其中氨基葡萄糖和半乳糖不能分離。在柱溫為35 ℃時，糖的保留時間均縮短，但甘露糖和木糖又不能分離。在柱溫為30 ℃時，各種糖組份都能夠達到基線分離。因此，選定色譜柱溫度為30 ℃。

圖3 不同溫度下各種糖的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of various sugars at different temperatures

2.3 微波水解–離子色譜法與常規水解–PMP衍生化–液相色譜法比較

常規水解–PMP衍生化–液相色譜法是目前多糖單糖組成常見的檢測方法，我們將建立的微波水解–離子色譜法與其在分析時間和分析結果方面進行了比較。結果表明，利用微波輻射的“內加熱”作用，能加快水解的作用，且不需要對水解樣品進行衍生化反應，整個樣品的分析時間從360 min縮短至65 min，大大提高了分析效率。分析結果比較表明，微波水解–離子色譜法的回收率略高于常規水解–PMP衍生化–液相色譜法，微波水解–離子色譜法含量分析結果比常規水解–PMP衍生化–液相色譜法多8.54%，差別并不顯著。說明微波水解多糖與常規烘箱加熱法相比，主要是能提高水解效率，而對水解產物無顯著影響。

表2 微波水解–離子色譜和常規水解–PMP衍生化–液相色譜法分析時間比較Table 2 Comparison of analysis time by the microwave hydrolyzation–ion chromatography and the conventional hydrolyzation–PMP derivatization-liquid chromatography

表3 微波水解–離子色譜和常規水解–PMP衍生化–液相色譜法分析結果比較Table 3 Comparison of analysis results by the microwave hydrolyzation–ion chromatography and the conventional hydrolyzation–PMP derivatization-liquid chromatography

2.4 離子色譜方法學研究

2.4.1 標準曲線、檢出限

9種單糖的質量濃度 x (mg/L)與其峰面積 y(nC· min)在0.05～80 mg/L范圍內具有很好的線性關系，線性系數R2均大于 0.998 5（如表 4）。9種糖的檢出限(20 μL 進樣，S/N = 3)在 2.0～9.0 μg /L范圍內。證明該方法檢測線性很好，線性范圍較寬，檢測靈敏度很高。

表4 9種單糖的檢出限及線性關系Table 4 Detection limit and linear relationship of 9 monosaccharides sample

2.4.2 方法精密度、穩定性及重復性

標準溶液連續進樣5次測定色譜峰峰面積，計算9種單糖的峰面積的RSD為1.32%～4.58%；取合適濃度的水解多糖樣品，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進行測定，計算各峰面積得RSD為1.45%～4.99%；平行制備水解多糖樣品溶液6份，經水解、稀釋后進行測定，RSD為1.31%～5.07%。以上結果表明，該方法精密度高、穩定性高、重現性好，可應用于多糖水解樣品中9種單糖的分析。

2.4.3 準確度實驗

分別加高、中、低 3個濃度的混合氨基酸對照品溶液各3份于已知含量的供試品溶液中，測其回收率，實驗結果表明各單糖于各濃度下的回收率均在80.4%～95.0%之間，RSD為2.36%～4.57%，說明本方法測定多糖水解液中各單糖含量回收率良好，準確度高。

2.5 香菇多糖離子色譜標準指紋圖譜的構建

2.5.1 香菇多糖離子色譜標準指紋圖譜

將 106個香菇多糖樣品的離子色譜圖譜數據轉換成CDF格式，導入指紋圖譜專用軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，見圖4。經多點校正、色譜峰匹配等軟件處理方法生成香菇多糖離子色譜標準指紋圖譜，見圖5。

圖4 香菇多糖的離子色譜圖譜Fig.4 Ion chromatogram of lentinan

圖5 香菇多糖的離子色譜標準指紋圖譜Fig.5 Standard fingerprint of ion chromatograms of lentinan

2.5.2 單糖標準品對照定性共有峰中的單糖峰

對照上述在同樣離子色譜條件下分析得到的9個單糖混合標樣的色譜圖見圖6A，比較圖中各峰的相對保留時間，可以確定香菇多糖指紋共有特征峰中有6個是單糖峰，依次為巖藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖。

圖6 9種單糖標樣（A）和香菇多糖樣品（B）的離子色譜圖Fig.6 A: Ion chromatograms of 9 monosaccharides standard sample; B: Ion chromatograms of lentinan sample

對 106批次香菇多糖樣品進行相似度評價，均在0.95以上，說明各批次間相似度良好，離子色譜指紋圖譜可作為香菇多糖質量控制和評價指標的重要參考依據之一。

3 結論

采用微波輔助酸水解法對香菇多糖樣品進行前處理，離子色譜檢測，優化了微波水解多糖條件和離子色譜條件，與常規水解–PMP衍生化–液相色譜法相比，該方法每個樣品的分析時間由原來的365 min縮短到65 min。方法學研究表明該方法準確性高，重現性、穩定性好，可應用于香菇多糖樣品的單糖組成分析。采用該方法對多批次香菇多糖樣品進行分析，構建基于多糖單糖組成信息的離子色譜指紋圖譜，為香菇多糖的質量控制提供更全面的參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。