燕麥麩皮與紅曲粉混合發(fā)酵條件的優(yōu)化

高宇琪，張秀金，李再貴

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083：2.中糧豐通（北京）食品有限公司，北京 102600）

燕麥（AvenasativaL.）是我國傳統(tǒng)糧食之一，也稱莜麥。與其他谷物相比，燕麥中的膳食纖維、脂肪酸、多酚等營養(yǎng)成分的含量更高[1]。麩皮是燕麥加工中的主要副產(chǎn)物。由于燕麥質(zhì)地柔軟且脂質(zhì)含量相對較高，胚乳不易分離干凈，導(dǎo)致燕麥麩皮中含大量的淀粉和蛋白質(zhì)[1]。燕麥中的蛋白質(zhì)、β-葡聚糖、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分多集中在麩皮部分，因此與燕麥相比，燕麥麩皮可富集除淀粉外的其他營養(yǎng)素[2-3]，其中 β-葡聚糖的含量更高。β-葡聚糖可降低血清膽固醇水平，因為 β-葡聚糖可增加腸內(nèi)物質(zhì)的粘度，延緩胃排空速率并抑制食物、消化酶以及膽汁鹽的混合和運輸，同時可干擾膽汁鹽的腸肝循環(huán)，促進(jìn)肝臟將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸[4-5]。

發(fā)酵工藝歷史悠久，具有改善食品營養(yǎng)價值、增加風(fēng)味以及延長保質(zhì)期的作用[6]。絲狀真菌通常具有安全性好，在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶以及β-葡萄糖苷酶，促進(jìn)發(fā)酵底物中營養(yǎng)成分的溶解和提取[7-8]。紅曲米（又稱：紅曲）是我國常用的一種食品著色劑，由稻米經(jīng)紅曲霉（MonascuspurpureusWent.）發(fā)酵而成。莫納可林K（Monacolin K）是紅曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要次級代謝產(chǎn)物。其中莫納可林K，又稱洛伐他汀（Lovastation），可抑制 HMG-CoA還原酶活性，從而阻止生物體內(nèi)膽固醇的合成，是一種廣泛使用的處方藥物[9-10]。紅曲色素屬于氮雜菲酮類化合物，以呈現(xiàn)黃色、橙色、紅色的色素為主[11-12]，動物實驗結(jié)果表明安卡紅曲黃素（Ankaflavin）可降低血清中總甘油三酯水平，具有一定的降脂作用[13]。

高膽固醇血癥是發(fā)展為心血管疾病（CVD）的重要因素之一，但是服用他汀類藥物具有多種副作用[14]，利用飲食療法應(yīng)對危險因素（如血清膽固醇水平升高）已成為預(yù)防CVD的關(guān)鍵方法。

本研究將紅曲米粉與燕麥麩皮粉混合后進(jìn)行半固體發(fā)酵，以莫納可林 K、β-葡聚糖、紅曲色素為評價指標(biāo)。比較不同發(fā)酵條件下燕麥麩紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中降脂成分含量的差異，明確發(fā)酵條件與降脂成分含量的關(guān)系，優(yōu)化紅曲米粉混合發(fā)酵燕麥麩皮的條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

燕麥麩皮：山西眾一農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；功能性紅曲粉：西安金碩果業(yè)有限公司。

1.2 實驗試劑

β-葡聚糖試劑盒：愛爾蘭 Megazyme公司；莫納可林K：Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈：Fisher試劑有限公司；磷酸：上海麥克林Macklin公司；實驗所用水均為去離子水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗設(shè)備

HZQ-100型恒溫震蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設(shè)備廠；YXQ-SG46-280A型（立式）高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CJ-1D型超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；WFZUV-2100型紫外可見分光光度計：尤尼克上海儀器有限公司；ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）和1260 Infinity II型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 混合發(fā)酵產(chǎn)物的制備

稱取90 g水、10 g燕麥麩皮于錐形瓶中，混合均勻，121 ℃、0.12 MPa滅菌20 min，冷卻至室溫后加入紅曲粉，于 160 r/min、30 ℃的條件下發(fā)酵，凍干后得燕麥紅曲混合發(fā)酵產(chǎn)物。

1.4.2 混合發(fā)酵的單因素確定

通過單因素實驗確定不同發(fā)酵條件對混合發(fā)酵產(chǎn)物的影響，每組實驗重復(fù)三次。發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響：在紅曲粉添加量為10 g、未調(diào)節(jié)水的pH值（pH = 6.7）的條件下，分別發(fā)酵24、48、72 和96 h；發(fā)酵用水的pH值對發(fā)酵的影響：在紅曲粉添加量為10 g，發(fā)酵72 h的條件下，通過1 mol/L HCl調(diào)節(jié)水的pH值分別為4.0、5.0、6.0以及6.7（未調(diào)節(jié)pH值）；紅曲粉添加量對發(fā)酵的影響：在未調(diào)節(jié)水的pH值（pH = 6.7）的條件下，紅曲粉添加量分別為5、10、15和20 g，發(fā)酵72 h。

1.4.3 水分的測定

根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》對樣品的水分進(jìn)行測定[15]。

1.4.4 β-葡聚糖的測定

發(fā)酵前后燕麥麩紅曲混合物中 β-葡聚糖的含量采用 Megazyme β-葡聚糖含量檢測試劑盒進(jìn)行測定，設(shè)置試劑空白組、葡萄糖對照組以及樣品組，具體方法參考試劑盒的使用說明書。

1.4.5 莫納可林K的測定

根據(jù)汪靜[16]等的方法并略作修改，利用高效液相色譜法（HPLC）對樣品中兩種結(jié)構(gòu)的莫納可林K進(jìn)行測定。

標(biāo)準(zhǔn)品對照液的配制：先配制 0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于4 ℃儲存，實驗時加入甲醇將內(nèi)酯型、酸型儲備液分別稀釋成 40.0 μg/mL、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品對照液，過濾后備用。

樣品溶液的配制：稱取0.2 g過篩（60目）后的樣品于10 mL容量瓶中，加7 mL甲醇搖勻，超聲40 min，冷卻后加甲醇定容，再超聲20 min使樣品充分溶解后定容。3 500 r/min，20 ℃條件下離心10 min。用0.22 μm 微孔濾膜過濾，待測。

按照汪靜[16]等的HPLC條件進(jìn)行測定，其中樣品進(jìn)樣量為10 μL，兩種構(gòu)型的莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)品對照液進(jìn)樣量依次為10、20、30和40 μL。

1.4.6 紅曲色素的測定

參考Pattanagul等[17]的方法測定發(fā)酵產(chǎn)物中色素的含量，利用95%乙醇（v/v）提取樣品中色素后，通過分光光度計分別在400、470和500 nm處測量黃色、橙色以及紅色可溶性色素提取物水平。

1.4.7 桔霉素的測定

根據(jù)GB 5009.222—2016《食品中桔青霉素的測定》對樣品中的桔霉素進(jìn)行測定[18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所用實驗數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示，通過SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行不同組別間的比較，Duncan分析進(jìn)行事后比較。其中P＜ 0.05時認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物有效降脂成分的影響

混合發(fā)酵是紅曲霉利用燕麥麩皮提供的碳源生長并產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的過程，因此發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中有效降脂成分有重要影響。莫納可林K可競爭性抑制HMG-CoA還原酶活性，包括內(nèi)酯型（閉環(huán)結(jié)構(gòu)）和酸型（開環(huán)結(jié)構(gòu)）兩種同分異構(gòu)體[19]。由表1可知，發(fā)酵時間對混合發(fā)酵產(chǎn)物中酸型莫納可林K幾乎沒有影響，但對于內(nèi)酯型莫納可林K具有顯著影響（P＜ 0.05），在96 h后可由1.77 mg/g增加至3.11 mg/g，總莫納可林K最高可提升至發(fā)酵前的1.6倍。利用提取液在不同波長時的吸光度值可表示不同顏色紅曲色素含量。經(jīng)不同時間發(fā)酵后，混合物中三種色素含量由大到小排序均為：黃色色素＞紅色色素＞橙色色素（見表2），這與Pattanagul等[17]在研究不同紅曲霉菌種對發(fā)酵后產(chǎn)生紅曲色素影響時的結(jié)果一致。三種色素的含量在48 h后與發(fā)酵前相比均具有顯著性（P＜ 0.05）且在96 h后具有最大值。微生物對不同碳源的利用具有一定選擇性，可分為速效碳源和遲效碳源[20]。由圖1可知，在前 48 h內(nèi) β-葡聚糖的含量無顯著性變化，而在72 h后 β-葡聚糖含量顯著降低（P＜ 0.05），96 h后降幅更達(dá)約77%。這是因為發(fā)酵過程中葡聚糖被酶解，時間越長，酶解越充分。根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物中三種有效降脂成分含量的分析，選定 72 h為最佳發(fā)酵時間。這一條件下，莫納可林K高于報道的數(shù)值[21]。

表1 不同發(fā)酵時間對莫納可林K含量的影響Table 1 The influence of different fermentation time on monacolin K content

表2 不同發(fā)酵時間對紅曲色素含量（吸光度值）的影響Table 2 The influence of different fermentation time on Monascus pigment content (absorbance value)

圖1 不同發(fā)酵時間對β-葡聚糖含量的影響Fig.1 The influence of different fermentation time on β-glucan content

2.2 發(fā)酵用水的pH值對發(fā)酵產(chǎn)物中有效降脂成分的影響

調(diào)整發(fā)酵用水的 pH值可改變微生物的膜結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，進(jìn)而影響物質(zhì)的吸收和釋放，最終導(dǎo)致微生物代謝發(fā)生改變[22]。由于燕麥麩中含有大量的膳食纖維，加水后膳食纖維吸水導(dǎo)致粘度明顯增加，另行調(diào)整物料的 pH值變得非常困難。所以在混勻燕麥麩皮時加入不同pH的發(fā)酵用水，以研究不同發(fā)酵用水pH對發(fā)酵產(chǎn)物的影響。實驗表明，改變發(fā)酵用水的 pH值對酸型、內(nèi)酯型以及總莫納可林K含量沒有顯著影響，pH = 6.7時總莫納可林K的含量最高（見表 3）。由表 4，發(fā)酵用水的 pH值僅對紅曲橙色色素影響較大，pH = 6.7（即未調(diào)節(jié)pH值）時橙色色素含量有明顯增加（P＜ 0.05），且此時色素總量最高。由圖 2可知，在未調(diào)節(jié)發(fā)酵用水 pH值時，β-葡聚糖的含量最低（P＜ 0.05）。調(diào)節(jié)發(fā)酵用水的pH值對紅色素和莫納可林的影響不大，而對燕麥麩皮中葡聚糖影響較大。添加pH5的水時葡聚糖含量最高（葡聚糖基本未降解，與原料麩皮中的葡聚糖差異不顯著），而發(fā)酵用水的 pH增加到6或者降低為4時，雖然與pH5沒有顯著性差異，但在數(shù)值上有所下降。而 pH進(jìn)一步增加到7時，葡聚糖明顯下降，這與盧穎的結(jié)論一致。可能是因為燕麥在一定的酸性條件下，葡聚糖水解酶被抑制，具有一定的緩沖作用[23]。因此，選擇在發(fā)酵時不調(diào)整發(fā)酵用水的pH值。

表3 不同發(fā)酵用水pH對莫納可林K含量的影響Table 3 The influence of different pH of fermentation water on monacolin K content (mg/g)

表4 不同發(fā)酵用水pH對紅曲色素含量（吸光度值）的影響Table 4 The influence of different pH of fermentation water on Monascus pigment content (absorbance value)

圖2 不同發(fā)酵用水pH對β-葡聚糖含量的影響Fig.2 The influence of different pH of fermentation water on β-glucan content

2.3 紅曲粉添加量對發(fā)酵產(chǎn)物中有效降脂成分的影響

紅曲粉添加量決定發(fā)酵過程中紅曲霉的接種量。接種量過少時，發(fā)酵周期長；接種量過高時不利于次級代謝產(chǎn)物的累積，而且造成資源的浪費。根據(jù)發(fā)酵前混合物中莫納可林K的含量可計算發(fā)酵后混合物莫納可林K的相對增加量。由表5可知，隨紅曲粉添加量增加，發(fā)酵產(chǎn)物中總莫納可林K含量上升，但相對增加量下降。添加量大于10 g時，總莫納可林K含量顯著上升（P＜0.05）。紅曲色素的總量與相對添加量的變化趨勢與莫納可林K一致，說明在低添加量時發(fā)酵進(jìn)程的效率較高（表6）。當(dāng)紅曲粉添加量為5 g時，培養(yǎng)基中的燕麥麩皮被充分利用，β-葡聚糖的含量僅為0.25%（圖3）；當(dāng)添加量的范圍為10 ～ 20 g時，β-葡聚糖的含量均為3%左右，與譚友莉[24]對市售青稞紅曲中β-葡聚糖含量（2.64% ～ 3.35%）檢測的結(jié)果相接近。利用免疫親和柱法對此條件下的樣品中桔霉素的含量進(jìn)行測定，未檢出說明安全性有一定保證。

表5 不同紅曲粉添加量對莫納可林K含量的影響Table 5 The influence of different additive amount of Monascus powder on monacolin K content

表6 不同紅曲粉添加量對紅曲色素含量（吸光度值）的影響Table 6 The influence of different additive amount of Monascus powder on Monascus pigment content (absorbance value)

圖3 不同紅曲粉添加量對β-葡聚糖含量的影響Fig.3 The influence of different additive amount of Monascus powder on β-glucan content

3 討論與結(jié)論

莫納可林 K是美國食品藥品監(jiān)督管理局（USFDA）批準(zhǔn)的一類降脂處方藥物，是紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中的重要降脂成分。且進(jìn)一步研究表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物中莫納可林K含量相近時，高紅曲色素含量的產(chǎn)物降脂效果更好[13]。同時，燕麥麩皮富含葡聚糖，也是應(yīng)用較廣泛的降脂成分。不過，紅曲發(fā)酵過程通常在提高莫納可林含量的同時伴隨著葡聚糖含量因水解而降低。本研究以提升莫納可林含量的同時盡可能控制葡聚糖水解為目標(biāo)，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵時間、發(fā)酵用水pH、紅曲粉添加量的單因素實驗，確定了燕麥麩皮與紅曲粉混合發(fā)酵的優(yōu)化條件。結(jié)果表明，在不調(diào)節(jié)發(fā)酵用水的pH值時，加入10 g紅曲粉發(fā)酵72 h可得到同時具有較高含量的莫納可林，葡聚糖和紅色素的發(fā)酵產(chǎn)物。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中既含有高含量的β-葡聚糖（3.31%），同時莫納可林K、紅曲色素分別提升至3.76 mg/g、27.58，且此條件下的燕麥麩與紅曲粉發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)。莫納可林，葡聚糖和紅色素的降脂機理與效率都有不同，包含了這三種成分的紅曲燕麥麩皮的降脂效果還有待于進(jìn)一步驗證，并以降脂效果為主要指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，是我們今后的研究目標(biāo)。