高效降解玉米蛋白粉益生菌篩選及生長特性研究

任 菲，劉玉春，王 超，郭 超

（國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037）

玉米是全世界的主要糧食作物之一，我國播種面積3億畝左右，年產(chǎn)量兩億多噸[1-2]。玉米蛋白粉是玉米淀粉加工生產(chǎn)過程的主要副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大。但由于玉米蛋白粉的水溶性差及直接利用的生物學(xué)價值低等原因，嚴(yán)重限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，大多僅被當(dāng)作飼料或廢棄物[1-2]。因此開發(fā)玉米蛋白粉高效加工利用技術(shù)具有重要應(yīng)用價值。玉米肽是玉米蛋白的水解產(chǎn)物，其具有易消化吸收、抗氧化等優(yōu)良特性[3-5]。目前利用玉米蛋白制備玉米肽的方法主要包括化學(xué)法、酶解法和微生物發(fā)酵法[2-3]，微生物發(fā)酵法產(chǎn)玉米肽，較之其他產(chǎn)肽方法（酶法和化學(xué)法），能修飾重組苦味基團，減少苦味，同時使玉米肽的抗氧化性、解酒、抗疲勞、降血壓、抗炎、抗癌、抗糖尿病等功能得到更充分的發(fā)揮和應(yīng)用[2,5-7]，是一項具有廣闊應(yīng)用發(fā)展前景的玉米蛋白粉加工技術(shù)。我國在生物活性肽尤其在玉米肽研究上起步晚于歐美，但是近些年越來越受到關(guān)注和重視[2,5-6]。但微生物發(fā)酵玉米蛋白粉產(chǎn)功能肽的研究相比酶法等還處于早期研究階段[2,6,8]，面臨適宜發(fā)酵微生物資源及其蛋白酶認(rèn)識和開發(fā)不足、微生物種類較單一以及相應(yīng)發(fā)酵工藝建立等亟待解決的問題。其中，篩選獲得降解玉米蛋白粉能力強和具高效蛋白酶活性的菌株成為微生物發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在。

鑒于此，本研究從多種來源樣品中，利用玉米蛋白粉固體篩培法和福林酚法等技術(shù)，分離篩選高蛋白酶活性的菌株；進行菌株鑒定及生長特性的研究，評價這些菌株的蛋白分解能力和可利用性能，為解決和提高微生物發(fā)酵玉米蛋白粉的高效微生物資源缺乏及發(fā)展應(yīng)用技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料

玉米蛋白粉及分離所用傳統(tǒng)發(fā)酵食品（酸奶、益生菌飲料、發(fā)酵面團等）：市購；菌株基因組提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）：北京天根生化科技有限公司；酪蛋白、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；配制培養(yǎng)基的各種樣品、試劑，均為國產(chǎn)分析純：國藥集團。

測定蛋白酶活的試劑：無水碳酸鈉溶液、三氯乙酸溶液、磷酸緩沖液（pH分別為 4.5、7.2、9.3）。

菌株分離純化采用 LB培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨 10.0 g、NaCl 10.0 g、瓊脂粉20.0 g、蒸餾水1.0 L、pH 7.0～7.5。

菌株篩選采用玉米蛋白粉培養(yǎng)基：玉米蛋白粉30 g、KH2PO43.0 g、K2HPO42.0 g、NH4Cl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 5.0 g、蛋白胨 1.5 g、牛肉膏 0.6 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水 1.0 L、pH 7.0～7.5。

玉米蛋白粉粉碎過 100目篩。以上培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值后，滅菌條件為121℃，20 min。

1.2 實驗儀器

pH計，F(xiàn)E20K：瑞士梅特勒–托利多（METTLER TOLEDO）公司；超凈工作臺，DL-CJ-1N：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，SHK-99-II：北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；微型旋渦儀，V2S02S：德國艾卡（IKA）公司；恒溫水浴鍋，SM-8D：南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，SynergvHT，美國伯騰（BIOTEK）公司；臺式高速冷凍離心機，EPPENDORF 5810R，德國艾本德 （EPPENDORF）公司；PCR儀，C1000 Touch：美國伯樂（BIORAD）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離純化

類似活動的靈活開展及現(xiàn)代技術(shù)手段加持，拓寬了非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳承與創(chuàng)新的渠道和方式，提高了社會成員的生活質(zhì)量和幸福指數(shù)，真正體現(xiàn)出終身教育“活到老，學(xué)到老”的內(nèi)涵意義，提升了社區(qū)教育的社會影響力和認(rèn)可度。

分離采用傳統(tǒng)平板涂布法。將樣品懸液適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的 LB瓊脂平板上，然后用無菌刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察挑取單個菌落。

純化采用平板劃線法。利用無菌接種環(huán)取菌株培養(yǎng)物少許在平板上進行劃線。經(jīng)培養(yǎng)后，劃線上的單個細(xì)胞形成純的單菌落。

1.3.2 菌株初篩

菌株純化菌液10～20 μL接種到玉米蛋白粉平板篩選培養(yǎng)基的無菌濾紙片上或空孔中（直徑均為0.5 cm），放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每隔 12 h觀察測定菌落周圍透明圈的大小。

1.3.3 菌株蛋白酶活性測定復(fù)篩

初篩后出現(xiàn)水解透明圈的菌株進行復(fù)篩。接種待測菌株于 LB液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)后，接種于玉米蛋白粉基礎(chǔ)發(fā)酵液培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，離心（4 000 r/min，10 min），取上清液為待測樣品，測定蛋白酶活性。按照福林酚試劑法測定發(fā)酵液中上清液的蛋白酶活性（GB/T 28715—2012飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定，SB/T 10317—1999蛋白酶活力測定法）。

1.3.4 序列分析和菌種鑒定

將分離純化后的細(xì)菌菌株接種到 LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h，再利用細(xì)菌基因組試劑盒提取基因組DNA。采取試劑盒抽提得到細(xì)菌DNA后，通過PCR擴增16S rDNA，配置50 μL的反應(yīng)體系，細(xì)菌16S rDNA引物為27F和1492R。PCR循環(huán)程序為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增得到的細(xì)菌PCR產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測序，測序的長度在1 400 bp左右。采用DNAMAN軟件序列圖譜對測序結(jié)果進行人工校對拼接，拼接后的序列在 NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索比對。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，選取測試菌株關(guān)系較近的模式菌株的16S rDNA序列區(qū)序列，Bioedit比對后用 MEGA X 軟件采取 ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可靠性檢驗bootstrap法，初始值1 000次。系統(tǒng)發(fā)育樹中本研究測得的序列號為MW090728-MW090784，Genbank中下載用于比對分析做系統(tǒng)發(fā)育樹的序列有 MH997645、MK993455、KY129662、MN227492、MT539148、MT039450、MK629812、MN209912、MN733170、NR_104873、KM234223、FJ613555、MN865799、MK990073、MT457707、NR_042254、MH734924、MN204064。

生長曲線。采用LB培養(yǎng)基，30 ℃測定菌株生長曲線。YTSS培養(yǎng)基，每隔 4 h取樣一次測OD600值。

生長溫度。配置LB培養(yǎng)基，2%接種量，在溫度梯度 4～70 ℃培養(yǎng)，測定菌株生長的溫度范圍及最適生長溫度。

生長pH。配置LB培養(yǎng)基，2%接種量，調(diào)配培養(yǎng)基pH 2～12，測定菌株生長的pH范圍及最適生長pH。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品菌株分離純化、菌株初篩及菌種鑒定

從各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品（酸奶、益生菌飲料、發(fā)酵面團等樣品中共分離菌株405株，其中通過玉米蛋白粉平板篩選培養(yǎng)基初篩出現(xiàn)透明水解圈菌株58株，透明水解圈一般經(jīng)過48 h培養(yǎng)后根據(jù)不同菌株情況陸續(xù)出現(xiàn)，部分菌株透明水解圈圖片見圖1，菌株透明圈（H/C）值最大可達4.2，多數(shù)在1.5～2.5之間。提取能夠產(chǎn)生透明水解圈菌株的基因組DNA，PCR擴增16s rDNA序列，并測序獲得高質(zhì)量序列信息，通過NCBI BLAST比對確定菌株分類地位。結(jié)果顯示篩選獲得的細(xì)菌歸屬于4科，5屬，17種，2個亞種。豐度最高為芽孢桿菌屬Bacillus，具體見分類表1。菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖2。

表1 分離菌株篩選鑒定結(jié)果Table 1 NCBI blast identification of isolated strains

圖1 玉米蛋白粉固體篩選培養(yǎng)基菌株水解透明圈圖Fig.1 Hydrolytic transparent circles of microbial strains of corn gluten meal screening medium

圖2 菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of microbial strains

目前，常見的產(chǎn)蛋白酶微生物包括枯草芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉等[1,7,9]。微生物發(fā)酵菌種的選擇標(biāo)準(zhǔn)一般有菌種繁殖速度快而穩(wěn)定、分泌酶能力強、耐受性強等[1,2,5,7]。本研究中分離菌株數(shù)目最多的為芽孢桿菌。芽孢桿菌既可以產(chǎn)生中性蛋白酶，又可以產(chǎn)堿性蛋白酶[1]，并且被收錄在我國食品目錄上，是比較安全可靠的菌種?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtilis），是常見的一種芽孢桿菌，分布廣泛，能夠幫助動物免疫器官發(fā)育，提升抗體和免疫球蛋白的水平，增強免疫力，還能夠合成多種維生素類，并能合成脂肪酶、纖維素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等酶類[1,5,7,10]。

研究中還發(fā)現(xiàn)了地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），該菌亦屬于芽孢桿菌屬。應(yīng)用價值廣泛，能夠凈化水質(zhì)、降解毒害物質(zhì)，調(diào)整腸道菌群及腸道功能，也能夠提高生物體免疫力，拮抗病原菌等，并具有較強的蛋白酶、脂肪酶、纖維酶活性[11-12]。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）在農(nóng)業(yè)上有促進植物生長和抵御病原微生物作用，具有廣譜抗菌活性，并且用于開發(fā)生物藥劑潛力巨大[13]。乳酸菌廣泛用于乳制品、肉制品、水產(chǎn)品和果蔬產(chǎn)品等發(fā)酵，還可產(chǎn)生抑菌活性的代謝產(chǎn)物，作為生物保護菌[14]，本研究也有分離到。

值得注意的是中華游動微菌（Planomicrobiumchinense）最早分離自我國海岸沉積物[15]，本研究分離自發(fā)酵海產(chǎn)品，而建立該屬的模式種韓國游動微菌（Planomicrobiumkoreense），也是分離自韓國傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)品[16]，也有該屬種分離自章魚腸道并報道具有蛋白酶活性[17]。

2.2 菌株蛋白酶活性測定復(fù)篩

篩選得到的58株菌株的堿性、中性、酸性蛋白酶活性測定結(jié)果見表 2。從研究結(jié)果可看出篩選獲得的菌株中性蛋白酶活性和堿性蛋白酶活性普遍高于酸性蛋白酶活性，并且堿性蛋白酶活性普遍較高，一般大于60 U/mL，大于90 U/mL的有8株，分離到的芽孢桿菌、乳酸菌、游動微菌等都表現(xiàn)出較高的蛋白酶活性，顯示出巨大的堿性蛋白酶資源潛力。

表2 菌株蛋白酶活性測定表Table 2 Protease activity of microbial strains U/mL

2.3 菌株生長特性研究

通過前面的菌株分離純化、初篩和蛋白酶活測定復(fù)篩，綜合透明圈大小、酶活高低、菌株種類等因素，選出8株菌株進行了生長特性研究。8株菌的生長曲線見圖3，生長溫度曲線見圖4，生長 pH曲線見圖 5。生長曲線中（圖 3），菌株的生長可分為兩大類，一類菌株CGM54、CGM40、CGM47、CGM48、CGM8在生長48 h左右達到峰值，另一類菌株CGM58、CGM56、CGM34在生長80 h左右達到峰值。生長最適溫度一般在30～40 ℃（圖 4）。生長最適 pH 一般在 7～9（圖 5）。

圖3 菌株生長曲線圖Fig.3 Growth curves of microbial strains

圖4 菌株生長溫度圖Fig.4 Growth temperature curves of microbial strains

圖5 菌株生長pH圖Fig.5 Growth pH curves of microbial strains

本研究中生長特性也表現(xiàn)出菌株特異性，不同菌株間存在顯著差異。細(xì)菌的生長繁殖一般包括四個階段，遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。大部分篩選菌株在接種后幾個小時內(nèi)可進入快速的指數(shù)生長期，少數(shù)菌株則有緩慢適應(yīng)生長階段后，再進入指數(shù)生長期；培養(yǎng)菌株的指數(shù)生長期的持續(xù)時間也存在不同。例如CGM34和CGM40，16S rDNA序列比對都鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），但其生長曲線存在較大差異。生長溫度、生長最適溫度、生長pH及生長最適pH等和已報道的同類別菌株基本一致[1,13,15,16]，如中華游動微菌（Planomicrobiumchinense）被報道在10～45 ℃生長，最適生長溫度為30～35 ℃，生長pH 5～10，生長最適pH 6～7[15]。菌株的生長特性研究十分重要，生長特性條件將為后續(xù)微生物發(fā)酵工藝的優(yōu)化和生產(chǎn)利用等提供參考和基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

篩選高效降解玉米蛋白粉的微生物菌株，是目前的重要研究領(lǐng)域。本研究分離篩選了高產(chǎn)蛋白酶菌株，從各種樣品中共分離菌株405株，其中通過玉米蛋白粉平板篩選培養(yǎng)基初篩出現(xiàn)透明水解圈菌株58株，確定了菌株的系統(tǒng)分類地位；并結(jié)合菌株分離純化、初篩和蛋白酶活測定復(fù)篩，綜合透明圈大小、酶活高低、菌株種類等因素，選出8株菌株進行了生長特性研究，菌株一般生長最適溫度一般在30～40 ℃，生長最適pH一般在7～9。蛋白酶活及生長特性等具有菌株特異性。本研究擴展豐富了后續(xù)微生物發(fā)酵玉米蛋白粉得到玉米肽的微生物菌株資源及微生物蛋白酶源，增加了微生物種類。后續(xù)將利用篩選菌株進行玉米蛋白粉微生物發(fā)酵產(chǎn)玉米肽的研究和優(yōu)化發(fā)酵工藝的探索，為玉米蛋白粉的增值和綜合利用提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。