基于生物信息學分析篩選腎透明細胞癌潛在預后生物標記物G蛋白信號調節因子3*

劉小雨，楊海波，張 倩，趙 語△

（1.重慶醫科大學附屬大學城醫院藥學部，重慶 401331； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院藥學部，重慶 400037）

腎細胞癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢［1］，根據病理類型分為腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、腎嫌色細胞癌（KICH）等，其中KIRC是最常見的病理亞型，約占75%［2］。早期KIRC主要通過手術治療，晚期及轉移性KIRC主要采用靶向治療，但以上方法在延緩腫瘤進展、提高生存率等方面作用仍有限［3］。近年來，靶向程序性死亡受體1（PD-1）／程序性死亡配體1（PD-L1）、細胞毒性T細胞相關抗原-4（CTLA4）的免疫療法已用于KIRC的治療，但僅部分患者能從中獲益。KIRC中存在高水平巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞的浸潤，且免疫細胞的浸潤水平對KIRC患者的預后有重要調控作用［4-5］。因此，腫瘤免疫浸潤水平影響腫瘤患者的預后［6］。研究KIRC浸潤相關免疫基因并篩選免疫浸潤標記物，對于改善KIRC的預后有重要意義。G蛋白偶聯受體信號通路參與腫瘤的發生與發展［7］，G蛋白信號調節因子3（GPSM3）是G蛋白偶聯受體信號調節因子［8］，可促進腫瘤的發生與發展［9］，但GPSM3在KIRC中的具體作用尚不清楚。本研究中利用多種生物信息學數據庫研究GPSM3在KIRC中的表達情況及與預后的相關性，以及對腫瘤免疫浸潤的影響，尋找KIRC潛在判斷預后的標記物。現報道如下。

1 數據庫選擇與分析方法

1.1 GPSM3在不同類型腫瘤組織中的差異表達分析

腫瘤免疫評估（TIMER）數據庫（https：／／cistrome.shinyapps.io／timer／）是綜合分析多種腫瘤與免疫細胞浸潤水平相關性的數據庫，可用于分析GPSM3在不同類型腫瘤組織中的表達。基因表達譜交互分析（GEPIA）數據庫（http：／／gepia.cancer-pku.cn／）屬腫瘤綜合分析數據庫，可用于進一步分析GPSM3在腫瘤和癌旁組織中的差異表達。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.2 GPSM3表達水平與腫瘤患者預后的相關性分析

癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫數據挖掘網站（UALCAN，http：／／ualcan.path.uab.edu／analysis.html）屬腫瘤在線分析數據庫。可利用UALCAN分析GPSM3的表達與腫瘤患者生存率的相關性，通過TIMER數據庫進一步分析GPSM3的表達與腫瘤患者累計生存率的相關性。進行Spearman等級相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義，1.3，1.5，1.6項同。

1.3 GPSM 3與腫瘤病理分期的相關性分析

利用GEPIA數據平臺提供的“Pathological Stage Plot”在線分析GPSM3表達水平與腫瘤病理分期的關系。

1.4 GPSM 3主要生物學功能分析

利用3.0版GSEA富集分析軟件分析，從TCGA數據庫中下載KIRC腫瘤組織樣本的RNA-seq數據（n＝538）。根據GPSM3表達水平的中位數將其分為高表達組和低表達組，結合MsigDB數據庫中的c5.bp.v6.2.symbols.gmt功能基因集對高表達組進行功能富集分析。以歸一化富集得分（NES）≥1.0、錯誤發現率（FDR）≤0.25、P＜0.05的基因集作為有意義的基因集合。

1.5 GPSM3與腫瘤免疫細胞浸潤水平的相關性分析

利用TIMER數據庫“gene”模塊分析GPSM3的表達與B細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等6種腫瘤免疫細胞浸潤水平的相關性。通過“Scan”模塊分析GPSM3基因拷貝數的改變對以上6種免疫細胞浸潤水平的影響。GPSM3基因拷貝數的改變分為“arm-level deletion”“diploid／normal”“arm-level gain”3個級別。

1.6 GPSM 3與免疫調節劑及趨化因子的相關性

TISIDB（http：／／cis.hku.hk／TISIDB／index.php）是一個包含30種癌癥類型的綜合分析腫瘤與免疫系統相互作用的數據庫。本研究中用其分析GPSM3與免疫調節劑（免疫增強劑和免疫抑制劑）及趨化因子的相關性。

2 結果

2.1 GPSM 3在腫瘤組織中的表達情況

圖1 GPSM3在腫瘤組織與癌旁正常組織中的表達情況Fig.1 The expression of GPSM 3 in tumor tissues and adjacent normal tissues

與相應癌旁正常組織比較，GPSM3在KIRC、乳腺浸潤癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、KIRP及前列腺癌（PRAD）中的表達水平顯著升高，在結腸癌（COAD）、KICH、肺腺癌（LUAD）及肺鱗癌（LUSC）中的表達水平顯著降低（P＜0.01），詳見圖1 A。與相應癌旁正常組織比較，GPSM3在CHOL及KIRC中呈顯著高表達，在LUSC中呈顯著低表達（P＜0.05），在其余8種腫瘤組織中的表達差異不顯著（P＞0.05），詳見圖1 B。

2.2 GPSM 3表達水平與腫瘤患者預后的關系

GPSM3的高表達顯著降低KIRC患者的生存率（P＜0.05），GPSM3的差異表達對CHOL及LUSC患者生存率無明顯影響（P＞0.05），詳見圖2 A。且TIMER數據庫分析結果與UALCAN數據庫一致，詳見圖2 B。因此，GPSM3的高表達是KIRC患者預后不良的預測指標。

2.3 GPSM 3表達水平與KIRC病理分期的關系

一般情況下，腫瘤病理分期越高，患者預后越差。本研究結果顯示，KIRC的病理分期越高，GPSM3的表達水平越高（P＜0.05），詳見圖3。

2.4 GPSM 3功能富集分析

GPSM3高表達組的樣本主要富集于適應性免疫、白細胞介導的免疫、白細胞的增殖與活化、T細胞的增殖與活化等免疫相關通路，詳見表1。因此，高表達GPSM3或在KIRC腫瘤免疫微環境中發揮了重要作用。

2.5 GPSM 3的表達與腫瘤免疫浸潤水平的關系

腫瘤免疫浸潤是腫瘤進展的關鍵因素，顯著影響腫瘤患者的生存率［5］。GPSM3的表達水平對數值與KIRC腫瘤純度呈負相關（cor＝-0.381），與腫瘤組織中B細胞［偏相關系數（partial cor）＝0.38］、CD8＋T細胞（partial cor＝0.549）、CD4＋T細胞（partial cor＝0.512）、巨噬細胞（partial cor＝0.483）、中性粒細胞（partial cor＝0.653）及樹突狀細胞（partial cor＝0.678）的浸潤水平呈正相關（P＜0.05），詳見圖4 A。GPSM3基因拷貝數的變化與腫瘤免疫細胞浸潤水平的降低相關（P＜0.05），詳見圖4B。以上結果提示，GPSM3的表達水平對數值與腫瘤免疫細胞浸潤水平呈正相關。

圖2 GPSM3表達水平與腫瘤患者預后的關系Fig.2 The correlation between the expression of GPSM 3 and the prognosis of tumor patients

圖3 GPSM3表達水平與KIRC病理分期關系的小提琴圖Fig.3 Violin diagram of the correlation between GPSM3 expression and KIRC pathological stage

2.6 GPSM3表達水平與免疫調節劑及趨化因子的關系

免疫調節劑如免疫抑制劑、免疫增強劑等是調控免疫系統的重要功能物質。有研究發現，趨化因子在調控腫瘤免疫浸潤中發揮了重要作用［10］。TISIDB分析結果見表2，可見，表中部分因子包括，可誘導共刺激分子（ICOS），殺傷細胞凝集素樣受體K1（KLRK1）、淋巴毒素-α（LTA）、組織相容性復合物Ⅰ類相關基因B（MICB）、腫瘤壞死因子受體超家族成員18（TNFRSF18）、集落刺激因子1受體（CSF1R）、CTLA-4、淋巴細胞激活基因3（LAG3）、半乳糖凝集素9（LGALS9）、PD-1、T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白（TIGIT）。

表1 GPSM3功能富集分析Tab.1 Enrichment analysis of GPSM 3 function

圖4 GPSM 3與腫瘤免疫細胞浸潤水平的相關性Fig.4 The correlation between GPSM3 and tumor immune cell infiltration level

表2 TISIDB數據庫對GPSM3與免疫調節劑及趨化因子的相關性分析Tab.2 The correlation between GPSM3 and immune modulators／chemokines in TISIDB database

3 討論

KIRC的發病率和死亡率不斷升高。近年來，以靶向免疫檢查點為核心的免疫療法為KIRC的治療帶來了希望，但大部分患者仍表現出耐受。腫瘤中免疫細胞浸潤水平顯著影響患者的臨床結局，故浸潤進腫瘤的免疫細胞被認為是潛在的藥物治療靶點。因此，需研究KIRC浸潤相關免疫基因并篩選免疫浸潤標記物。

GPSM3是G蛋白耦聯受體調節因子［7］，目前關于其在腫瘤中的作用相關研究較少。本研究中分析了GPSM3在KIRC中的表達水平及對預后的影響，結果與癌旁組織相比，GPSM3在KIRC中呈高表達且與患者預后不良呈正相關。且KIRC，KIRP，KICH是RCC的3種病理亞型，與癌旁組織相比，GPSM3僅在KIRC中高表達，說明通過GPSM3表達水平的高低還可初步判斷RCC亞型，協助臨床做出診斷。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）屬炎性小體，可抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移及誘導凋亡，且NLRP3在KIRC腫瘤組織中呈低表達［11-12］。另有研究發現，GPSM3可抑制NLRP3的活性，提示過表達GPSM3可能通過抑制NLRP3促進KIRC細胞的侵襲及轉移，從而抑制腫瘤細胞的凋亡［13］。腫瘤血管的生成可促進腫瘤的發生與發展，有研究模擬腫瘤微環境中血管的生成，發現GPSM3在其中的表達增加了2倍以上，說明GPSM3介導了腫瘤的發生與發展［14］。但關于GPSM3在抗腫瘤免疫調節中的作用尚不清楚。

腫瘤中浸潤的免疫細胞可調控腫瘤的發生與發展［10］，故進一步探索新的免疫調節劑有助于了解腫瘤與免疫微環境的相互作用。本研究中，GPSM3在調控KIRC腫瘤免疫浸潤中發揮重要作用。首先，基因富集分析（GSEA）功能富集分析顯示，GPSM3高表達參與白細胞及T細胞的增殖與活化。其次，GPSM3可促進腫瘤免疫細胞如中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤。且GPSM3與多種免疫抑制劑、免疫增強劑及趨化因子呈顯著正相關。有研究指出，中性粒細胞可在有差異的腫瘤微環境下促進腫瘤的發展及轉移［15］。有研究發現，KIRC中中性粒細胞的浸潤促進了腫瘤細胞的增殖［16］。另外，樹突狀細胞也在腫瘤免疫過程中發揮著關鍵的調節作用，不僅能誘導抗腫瘤免疫反應，還可誘導免疫耐受［17］。樹突狀細胞可誘導調節性T細胞的增殖［18］，而調節性T細胞在維持自身免疫耐受中發揮重要作用［19］。此外，趨化因子受體表達于多種免疫細胞，且趨化因子可調控免疫細胞向腫瘤微環境中募集［10］。有研究發現，趨化因子可促進中性粒細胞及樹突狀細胞向腫瘤部位募集［10，20］。以上研究結果提示，高表達GPSM3可能通過提高中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平而降低KIRC患者的生存率。此外，靶向PD-1／PD-L1及CTLA4的免疫療法對KIRC治療響應性低，故改善腫瘤對免疫療法的反應是關鍵途徑。本研究中，GPSM3與免疫調節劑PDCD1及CTLA4呈顯著正相關，提示靶向給予GPSM3可能為提高免疫療法的療效提供了新策略。故進一步探討GPSM3調控腫瘤免疫浸潤的具體作用機制具有重要意義。

綜上所述，GPSM3在KIRC中高表達且與患者預后不良呈正相關，GPSM3表達水平與腫瘤免疫浸潤水平呈顯著正相關。本研究中揭示了GPSM3在調節KIRC免疫中新的潛在功能，其有望成為KIRC的預后生物標記物。