正交試驗與響應面法優選六月雪-草藥對提取工藝比較*

范 玲，王 鑫△，胡風華，金慶江，尹 浩，駱建平，薛 毅

（1.江蘇省蘇州市中西醫結合醫院，江蘇 蘇州 215101； 2.南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 南京 225300）

糖尿病腎病是導致慢性腎臟病的第二位原因［1］，糖代謝紊亂是其主導因素［2］。中醫認為，脾腎受損、氣陰兩傷、虧虛不足、脈絡瘀阻是糖尿病腎病的主要病因病機，常以補腎健脾、益氣養陰、活血化瘀通絡的藥物進行調理。六月雪-草是蘇州市中西醫結合醫院金慶江主任中醫師治療糖尿病腎病的經典藥對，六月雪始載于《本草拾遺》，來源于茜草科植物小灌木白馬骨Serissa serissoides（DC.）Druce的全草或根，性涼，味苦、微辛，歸肺、脾、肝、胃經［3］。六月雪含揮發油類［4］、醌類［5］、木脂素類［6］、萜類［7］、黃酮類［8］等化學成分，具有抗病毒、抑菌等藥理作用。草始載于《新修本草》，來源于桑科草屬草Humulus scandens.（Lour.）Merr.的全草，性寒，味甘、苦，歸肺、腎經［9］。草含黃酮類、甾體類［10］等多種化學成分，有治療急慢性腎炎、抗菌、抗炎等藥理作用。現代藥理學研究結果顯示，六月雪能改善機體對抗原的清除作用，對受損的腎小球基底膜有一定修復作用，而草有治療腎炎的作用，二者相須，聯用效果更甚。本研究中探討了六月雪-草藥對的提取工藝，旨在為該藥對的物質基礎研究提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；FA2004型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）；B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DW-2型調溫電熱套（通州市張芝山鎮決心化工電器廠）。

1.2 試藥

木犀草苷對照品（西安菲德生物科技有限公司，批號為19070302，含量為99.40%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗用水為娃哈哈純凈水；六月雪、草藥材均購于蘇州天靈中藥飲片有限公司，經蘇州市中西醫結合醫院于棟偉主任中藥師鑒定為正品。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2 方法與結果

2.1 木犀草苷含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×2.1 mm，4μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83，V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：350 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取木犀草苷對照品3.0 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品溶液。分別稱取六月雪10 g、草5 g，回流提取，濾過，合并濾液，濃縮后作提取液。精密量取樣品溶液10 mL，置蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10 mL，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。稱取六月雪藥材10 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.1.2項下3種溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處有吸收峰，陰性對照無干擾。理論板數按木犀草苷峰計應不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。見圖1。

線性關系考察：精密量取2.1.2項下木犀草苷對照品溶液適量，加流動相制成質量濃度分別為6，12，15，24，30μg／mL的系列對照品溶液，置容量瓶中。按2.1.1項下色譜條件進樣測定。以待測成分質量濃度為橫坐標（X）、峰面積值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y＝22.34X＋17.65，r＝0.999（n＝5）。結果表明，木犀草苷質量濃度在6～30μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：取2.1.2項下木犀草苷對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以信噪比（S／N）為3∶1的質量濃度為檢測限，S／N為10∶1時的質量濃度為定量限。結果檢測限和定量限分別為0.603 2μg／mL和2.084 9μg／mL。

精密度試驗：精密量取已知含量（15μg／mL）的對照品溶液10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。于1 d內連續進樣6次，測定峰面積，結果的RSD為0.36%（n＝6），表明該方法日內精密度良好。于1 d內連續進樣2次，連續3 d，測定峰面積，結果的RSD為0.98%（n＝6），表明該方法日間精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，室溫下分別放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件測定。結果的RSD為1.87%（n＝6），表明室溫下供試品溶液在24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一供試品溶液6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果的RSD為0.52%（n＝6），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知質量濃度的供試品溶液（木犀草苷質量濃度為11.57μg／mL）6份，每份10 mL，置蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容，分別精密量取10 mL，各加入0.12 mg木犀草苷對照品。經0.45μm微孔濾膜濾過。按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果見表1。

2.2 正交試驗

2.2.1 試驗設計

根據預試驗結果，以加水倍數（A）、提取時間（B）及提取次數（C）為考察因素，以木犀草苷提取綜合評分為考察指標，采用L9（34）正交試驗優選木犀草苷的提取工藝。因素與水平見表2。藥對中六月雪草比例為2∶1，即六月雪10 g、草5 g。試驗過程中煎煮時使用電熱套加熱圓底燒瓶內回流提取，整個過程水分不流失。最后以木犀草苷轉移率及水煎液浸膏得率的綜合評分進行分析，綜合評分＝木犀草苷轉移率／木犀草苷轉移率的最大值×70＋浸膏得率／浸膏得率的最大值×30。其中木犀草苷轉移率（%）＝提取液中木犀草苷含量×100%／按藥典測定的飲片中木犀草苷含量；浸膏得率（%）＝L×（m2-m1）／5×1／m×100%。L為煎煮后提取液總體積（mL），m2為含提取液的蒸發皿的質量（g），m1為蒸發皿凈質量（g），m為煎煮飲片總質量（g）。正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

由表3可見，各因素對試驗檢測指標的影響強度高低順序為C＞B＞A；由表4可見，因素C對檢測結果有顯著影響。提取次數是影響綜合評分的關鍵因素。分析得到的六月雪-草藥對的最優提取工藝條件為A2B3C3，即加15倍水，提取3次，每次提取1.5 h。

表2 正交試驗因素水平表Tab.2 The factors and levels of the orthogonal test

表3 L 9（34）正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the L 9（34）orthogonal test

表4 正交試驗方差分析結果Tab.4 ANOVA results of the orthogonal test

2.2.2 驗證試驗

以最優提取工藝進行驗證試驗，所得綜合評分的平均值為91.36分，RSD為0.97%，數據穩定，表明此提取工藝穩定可靠。

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗設計、結果與分析

依照Box Behnken響應面法的設計原理，利用Design Expert 8.0.6.1軟件設計了以加水倍數（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）為自變量，以木犀草苷轉移率及提取液的浸膏得率的綜合評分為考察指標，進行三因素、三水平響應面法試驗。因素及水平見表5，響應面設計方案及試驗結果見表6，模型分析及方差分析結果見表7。

進行多元回歸擬合分析，得綜合評分對3個因素的二次多項回歸方程為R1＝82.92＋7.94 A＋0.39B＋21.81 C-5.13 AB＋2.75 AC-1.48 BC-11.93 A2-1.78B2-9.21 C2。由表6可知，加水倍數和提取次數對水煎液提取的影響極顯著，而交互項（AB，AC，BC）均無顯著影響。二次項中，A2及C2對水煎液提取的影響極顯著。模型決定系數R2為0.938 0，模型的失擬項F＝6.26，顯著性水平P＝0.054 3＞0.05，失擬項并不顯著，表明此模型擬合效果好，可很好地反映綜合評分與3個因素的關系。綜上所述，對綜合評分影響強弱順序為C＞A＞B。

表5 響應面試驗因素水平表Tab.5 The factors and levels of the response surface methodology

表6 響應面試驗設計方案與結果Tab.6 Design and results of the response surface methodology

表7 模型分析及方差分析結果Tab.7 Results of model analysis and ANOVA

2.3.2 響應面圖分析

響應面三維圖［11］見圖2。

由圖2 A可見，提取時間為0.5～1.0 h時，綜合評分隨著加水倍數的增大而逐漸升高，當提取時間超過1 h時，綜合評分隨加水倍數的變化而呈緩慢升高-降低的趨勢；加水倍數為10～15倍時，綜合評分隨提取時間的延長而呈明顯升高趨勢，而當加水倍數超15倍時，綜合評分隨提取時間的延長呈升高-降低趨勢。

由圖2 B可見，加水倍數和提取次數對綜合評分的影響較大。當加水倍數為10～15倍時，綜合評分隨提取次數的增加而顯著升高；提取次數為1～2次時，綜合評分隨加水倍數的增加而升高，提取次數超過2次時，綜合評分隨加水倍數的增加而呈緩慢升高-降低的趨勢。

由圖2 C可見，響應曲面圖所呈現的曲面較平滑，表示此交互項的作用并不明顯，但也有一定協同作用。

2.3.3 驗證試驗

為保證試驗的可行性，將上述工藝條件修正為：加18倍水，提取3次，每次0.8 h。按此條件進行電熱套加熱圓底燒瓶內回流提取六月雪-草藥對中木犀草苷試驗和浸膏試驗，實測綜合評分平均值為97.56分，RSD為1.24%，數據穩定，且與預測值相比，相對誤差較小，表明建立的模型和實際情況基本吻合。

2.4 浸膏得率

取供試品溶液分別精密量取5mL，置已干燥至恒重的蒸發皿，水浴蒸干。再于105℃干燥3h，立即置干燥器中靜置冷卻30min。然后迅速精密稱量，記錄，并計算浸膏得率。

2.5 兩種試驗方法比較

由前文可知，按最優工藝條件提取時，響應面法所得綜合評分高于正交試驗法。正交試驗中，3個因素中僅提取次數對綜合評分有顯著影響（P＜0.05），在響應面法中提取次數和加水倍數均對綜合評分有顯著影響。表明響應面法相對更能體現多因素與響應值間的關系。

正交試驗法相較于響應面法，試驗組數少，更簡單易行，但有一定局限性；響應面法試驗組數較多，但更加精確，三維圖分析更直觀，預測能力更強，得率也更高。響應面法依據試驗結果擬合出模型來進行工藝優化，是在一個連續區域內篩選的最優方案，這可能是響應面法與正交試驗法相比更能精確地優化提取工藝的原因［12］。但響應面法需通過更多試驗組合來進行模型擬合及響應值預測，其工作量要遠大于正交試驗法［13］。因此，對于影響因素較少且不需太精確的工藝可使用正交試驗法進行優選，但對于影響因素較多且各因素間關系較復雜的工藝則建議使用響應面法試驗進行優化。

3 討論

圖2 綜合評分影響因素三維圖Fig.2 Three dimensional diagram of comprehensive score of influencing factors

與正交試驗法相比，響應面法綜合評分更高，更適用于優化六月雪-草藥對的提取工藝。驗證試驗表明，六月雪-草藥對提取液的浸膏得率和木犀草苷的含量穩定、重復性好，本研究為六月雪-草藥對的進一步研究奠定了技術基礎。