正交試驗優選枳殼提取工藝*

徐坤勇，顏 娟，韻國萍△

（1.河北省張家口市第一醫院，河北 張家口 075000； 2.河北北方學院附屬第一醫院，河北 張家口 075000）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實，炮制品為不規則弧狀條形薄片。枳殼性微寒，味苦、辛、酸，歸脾、胃經，有行滯消脹、理氣寬中功效，臨床可用于治療胃下垂、子宮脫垂、食積不化、脹滿疼痛、胸肋氣滯、痰飲內停等癥［1］。黃酮化合物為枳殼主要化學成分，新橙皮苷和柚皮苷為黃酮類化合物的主要成分，具有抗過敏、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗微生物、保護受損心肌、誘導甲狀腺癌細胞凋亡、抗基因突變等多種藥理作用［2-5］。目前，枳殼的提取工藝主要包括熱水煮取法、超聲提取法、堿溶酸沉法等［6-8］，存在溶劑消耗大、耗能、產率不高、耗時等問題。為考察各因素對枳殼提取工藝的影響，提高提取效率，節約能源，本研究中以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率為綜合評價指標，采用正交試驗法優選枳殼的提取工藝，找出最佳提取條件，為該藥材的開發應用提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；KQ-250DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（重慶對照品科技有限公司，批號為110722-201312，含量≥98%）；新橙皮苷對照品（西安旭煌技術有限公司，批號為N-19020，含量≥97%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水；枳殼樣品（張家口市張垣中藥飲片有限公司，批號為20190801）。

2 方法與結果

2.1 柚皮苷及新橙皮苷含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水溶液（20∶80，V／V，用磷酸調pH至3）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：283 nm；柱溫：室溫，進樣量：10μL。理論板數按柚皮苷峰計應不低于3 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液制備

分別稱取柚皮苷對照品40.01 mg、新橙皮苷對照品40.00 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲使溶解，搖勻，即得單一對照品貯備液。精密量取上述溶液各2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL分別含柚皮苷和新橙皮苷各160μg的混合對照品溶液。取枳殼粗粉約0.2 g，精密稱定，提取，放冷，濾過，蒸發皿中蒸干，加甲醇溶解，并洗滌干凈后轉移至100 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲（功率250 W，頻率40 kHz），搖勻，即得供試品貯備液。移取5mL，0.45μm微孔濾膜濾過，取1 mL中間續濾液，即得供試品溶液。按枳殼處方及工藝制備缺柚皮苷、新橙皮苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系與定量限、檢測限考察：分別精密量取2.1.2項下混合對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為12，24，48，96，192，240μg／mL的系列混合對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別以待測成分峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，柚皮苷為Y1＝5.39×103X1＋4.22×104，r1＝0.999 6（n＝6）；新橙 皮苷為 Y2＝6.12×103X2＋5.21×104，r2＝0.999 7（n＝6）。結果表明，柚皮苷、新橙皮苷質量濃度均在12～240μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。同時，以信噪比（S／N）為10和3的質量濃度進樣，測得柚皮苷的定量限和檢測限分別為1.38μg／mL和0.42μg／mL，新橙皮苷定量限和檢測限分別為1.13μg／mL和0.35μg／mL。

精密度試驗：精密量取2.1.2項下混合對照品溶液10μL，按2.1.1項色譜條件連續進樣6次，測定。結果柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.72%和0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密量取2.1.2項下供試品溶液10μL，室溫下分別于0，1，2，5，10，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為1.09%和0.92%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

重復性試驗：取藥材樣品粗粉6份，按2.1.2項下方法平行制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為7.37%和4.24%，RSD分別為0.87%和1.12%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的藥材樣品（含柚皮苷約為7.38%、新橙皮苷約為4.27%）粗粉6份，精密稱定，每份約0.2 g，分別加入柚皮苷及新橙皮苷對照品約14.76 mg和8.54 mg，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery tests（n＝6）

2.2 收膏率測定

精密量取2.1.2項下供試品貯備液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中水浴蒸干，105℃干燥3 h后取出，置干燥器中冷卻，至常溫后立即稱定質量。收膏率＝（浸膏質量／20×100）／藥物總質量×100%。

2.3 正交試驗設計

根據預試驗結果和實際生產條件，參考文獻［9-12］，以液料比（A）、提取時間（B）及提取次數（C）為考察因素，以柚皮苷、新橙皮苷的含量和收膏率為綜合評價指標［13-14］，采用L9（34）正交試驗法優選枳殼的提取工藝。因素水平見表2，正交試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。由表3、表4可知，以柚皮苷、新橙皮苷含量為考察指標時，3個因素均為不顯著因素；以收膏率為考察指標時，僅因素A為顯著因素，故因素A確定A2為最佳水平。為節約能源，提高提取效率，滿足工業化生產需要，確定最優提取工藝條件為A2B2C2，即液料比8∶1，每次提取1.5 h，提取2次。

表2 正交試驗因素水平表Tab.2 The factors and levels of the orthogonal test

表3 正交試驗設計及結果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

2.4 工藝驗證試驗

稱取枳殼100 g，精密稱定，共3份，按A2B2C2工藝條件進行提取，測定柚皮苷、新橙皮苷的含量和收膏率，對3批進行驗證試驗。結果見表5。結果表明，該提取工藝重復性好，工藝穩定，合理可行。

3 討論

水為實際生產中常見的優良溶劑，極性強，適宜提取苷類等極性大的化合物，且環保、安全。柚皮苷即4，5，7-三羥基-黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，微溶于冷水，在熱水中有一定溶解度［15］，預試驗結果顯示，其在50℃水中溶解性能良好。乙醇對天然植物細胞的穿透能力較強，來源方便，價格便宜，50%～70%乙醇常用于天然藥物中柚皮苷等苷類化合物的提取［16-17］。故暫定用50℃水和60%乙醇進行提取試驗。試驗中，保持其他條件相同，分別以50℃水和60%乙醇為提取溶劑對枳殼藥材進行提取，高效液相色譜法對指標成分柚皮苷、新橙皮苷含量進行測定，同時考察收膏率。結果表明，采用50℃水和60%乙醇對枳殼提取各項考察指標的影響差異不大，考慮生產成本，故采用50℃水提取。

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

表5 工藝驗證試驗結果（%）Tab.5 Results of the validation test（%）

在中藥研制過程中，為保證藥材提取質量，故選用多指標評價提取工藝。枳殼藥效成分主要為黃酮類化合物，其中柚皮苷含量較高；新橙皮苷為2015年版《中國藥典（一部）》中藥材枳殼含量測定指標成分之一；收膏率作為中藥提取工藝的常用評價指標之一，可反映各組分的提取程度［18］。故本研究以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率為評價指標，優化枳殼提取工藝，以期為工業化生產奠定基礎。驗證試驗結果表明，優選的提取工藝，柚皮苷、新橙皮苷的平均含量均明顯高于劉學仁等［19］采用微波輔助提取法所得結果，提取效率明顯提高。

綜上所述，該提取工藝穩定可行，重復性好，且提取效率高。