長春西汀注射液中2種磺酸酯類基因毒性雜質的測定*

焦 潔，妙 苗，王 濤，蔡 虎

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院·國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065）

長春西汀注射液是由主藥長春西汀和輔料山梨醇、苯甲醇等經現代工藝精制而成的無菌注射液，臨床主要用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動脈硬化癥等誘發的各種癥狀［1］。其主藥以長春胺為起始原料，經脫水消除、水解和酯化制得。在長春西汀中間體制備過程中使用了對甲苯磺酸作催化劑，后續處理過程中雖進行了充分洗滌，但仍可能存在對甲苯磺酸殘留，在后續的酯化反應中會繼續反應，生成基因毒性雜質對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯，故需在成品的質量控制中嚴格控制后兩者含量。目前，對甲苯磺酸酯類的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法［2-8］、液質聯用法［9-12］、氣質聯用法［13-15］等。HPLC法具有成本低、分離快、靈敏度高、適用于熱不穩定化合物等優點。本研究中建立了測定長春西汀注射液中對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯含量的HPLC法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀，含2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；XPE-105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

對甲苯磺酸甲酯對照品（批號為F1012054，含量為98.0%），對甲苯磺酸乙酯對照品（批號為E1012037，含量為98.0%），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；長春西汀注射液（7個廠家，共79批，包括2mL∶10mg，5 mL∶30 mg，2 mL∶20 mg 3種規格）；磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為高純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersODS2C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61，V／V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：226nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取對甲苯磺酸甲酯對照品和對甲苯磺酸乙酯對照品各適量，精密稱定，用流動相溶解，并制成兩者質量濃度均約為0.25μg／mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：取2 mL∶20 mg規格樣品3支，混勻，精密量取5 mL，置10 mL容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得；其余規格樣品，直接取樣品溶液進樣。

陰性對照品溶液：根據各廠家提供的長春西汀注射液處方，取山梨醇、苯甲醇、維生素C、焦亞硫酸鈉、酒石酸等輔料適量，用流動相溶解并濾過，取濾液，即得。

空白溶液：取流動相，作為空白溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下除供試品溶液外的3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，理論板數以對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰計分別為13 359和13 880，分離度為9.2，空白溶液和陰性對照品溶液對測定無干擾。詳見圖1。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the specific test

線性關系考察：取對甲苯磺酸甲酯12.24 mg和對甲苯磺酸乙酯9.27 mg，精密稱定，置同一100 mL容量瓶中，用流動相溶解，并定容，搖勻。精密量取2.5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，作為線性試驗混合對照品貯備液。精密量取1，1.5，2，3，4 mL，分別置20 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻，即得線性混合對照品溶液。精密量取20μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，得回歸方程，對甲苯磺酸甲酯為Y1＝63 593.589 2X1-309.226 0（r1＝0.999 9，n＝5），對甲苯磺酸乙酯為Y2＝61 195.719 7 X2-317.174 5（r2＝0.999 8，n＝5）。結果表明，對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯質量濃度分別在0.149 9～0.599 8μg／mL和0.1136～0.4542μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

回收率試驗和加標重復性試驗：考慮到各廠家間工藝、處方的差異，取長春西汀注射液使用輔料最多的G公司生產批號為1901261的樣品10支（規格為2 mL∶20 mg，均未檢出對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯），混勻，精密量取2 mL，共6份，分別精密加入一定量的對照品溶液2 mL，搖勻。精密量取20μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，按外標法計算回收率。結果見表1。根據2015年版《中國藥典（四部）》通則0901分析方法驗證指導原則中回收率相關要求，待測成分含量在0.1%時，回收率限度為90%～108%。本方法試驗中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的回收率分別為98.78%和99.33%，表明準確度符合要求。6份加標樣品中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯含量的RSD均小于3.0%，表明方法的重復性符合要求。

表1 回收率試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

定量限和檢測限確定：取線性混合對照品溶液，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣分析，得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的定量限（信噪比＞10時）分別為0.037μg／mL和0.045μg／mL，檢測限（信噪比＞3時）分別為0.015μg／mL和0.023μg／mL。

精密度試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液20μL，連續進樣測定6次。結果對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD分別為0.92%和1.96%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液，于室溫放置0，1，2，3，4，5，6，7，8h時分別按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積有變小的趨勢，RSD分別為4.00%和4.20%（n＝9），建議供試品溶液在配制后6h內測定（此時的RSD均小于2.0%）。

2.4 樣品測定

分別取7個廠家各1批樣品（A公司，批號為191108；B公司，批號為P1／20190901；C公司，批號為A92055A；D公司，批號為11904042；E公司，批號為1902211；F公司，批號為1906181；G公司，批號為1901241），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。按外標法計算，結果均未檢出對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯。

3 討論

3.1 流動相優化

圖2 7批樣品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of seven batches of samples

預試驗中先后考察了3種流動相：①乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61，V／V），檢測波長為226 nm；②乙腈-水（40∶60，V／V），檢測波長為220 nm；③乙腈-0.2 mol／L醋酸銨溶液（50∶50，V／V），檢測波長為260 nm。結果發現，3種流動相均可滿足系統適用性試驗要求，但流動相③的檢測限比流動相①和流動相②約高10倍，流動相②的系統耐用性較差，故選擇流動相①。

3.2 色譜柱選擇

預試驗中先后考察了3種色譜柱：①Waters ODS2 C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；②Agilent TC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；③ACEExcel C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。結果發現，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時，3種色譜柱均可滿足系統適用性試驗要求，但選擇色譜柱②和色譜柱③時，2種待測物出峰時間均晚于長春西汀主成分，由于供試品溶液濃度較大，有拖尾現象，導致2種待測組分的靈敏度低，達不到限度要求。選擇色譜柱①時，2個待測組分在長春西汀主峰前流出，可杜絕高濃度樣品對待測組分的干擾，降低基線噪音，提高檢測的靈敏度。故選擇色譜柱①。

3.3 待測物確認

試驗過程中發現，供試品溶液色譜圖中，在待測物保留時間附近還有其他色譜峰，為排除因保留時間漂移引起的漏檢，對上述樣品均進行加標回收驗證，試驗結果表明，該色譜峰不是待測物，應為長春西汀原料引入的其他雜質。

3.4 限度確定

根據人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）的規定，基因毒性雜質的最大攝取量為1.5μg／d［16-17］，長春西汀每天最大用量為30 mg，按此計算，確定對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的限度不得超過0.005%。

3.5 方法評價

本研究中建立的HPLC法可快速、準確地對注射用長春西汀中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯進行定性及定量分析，避免使用液質儀、氣質儀等貴重和普及度較低的儀器，降低了檢驗成本，提高了方法的可行性，可為該藥中潛在的有害雜質的檢測提供參考。