郁金配方顆粒HPLC指紋圖譜及指標成分含量測定研究*

姚 瑤，趙淑淑，姚俊霞，黃 琪，朱方劍，信文娟

（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，浙江 湖州 313200）

郁金為姜科植物溫郁金Curcumawenyujin Y.H.Chen et C.Ling、姜黃Curcuma longa L.、廣西莪術Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或蓬莪術Curcuma phaeocaulis Val.的干燥塊根［1］。溫郁金是浙八味的道地藥材，具有行氣解郁、活血止痛、利膽退黃等功效［2］?，F(xiàn)代研究表明，溫郁金藥材中含有0.3%的揮發(fā)油，主要成分有莪術醇、吉馬酮、異龍腦、龍腦等［3-5］。郁金配方顆粒以郁金藥材為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥等工序制備而成。目前，市場上郁金配方顆粒生產(chǎn)廠家較多，為保證其治療效果穩(wěn)定，需對產(chǎn)品進行質(zhì)量控制。本研究中建立了郁金配方顆粒高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并同時測定制劑中尿苷、腺苷的含量，為中藥配方顆粒的質(zhì)量研究提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260-G205型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BT25S型電子分析天平（瑞士Sartorius公司，精度為0.01 mg）；KQ-500VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

郁金配方顆粒（4個不同廠家，批號分別為1906001，191001，1911003，Y20190411）；尿苷對照品（批號為110887-201803，含量為99.5%），腺苷對照品（批號為110879-201703，含量為99.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch UltimateAQ-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時0A，10～20 min時0 A→2%A，20～30 min時2%A→10%A，30～45 min時10%A→15%A，45～55 min時15%A）；流速：0.8 mL／min；檢測波長：260 nm；柱溫：30℃。

2.2 溶液制備

取尿苷、腺苷對照品各適量，精密稱定，加水制成每1 mL分別含尿苷和腺苷各10μg的混合對照品溶液。取樣品（批號為1906001）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，離心，取上清液5 mL，蒸干，殘渣用10%甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按郁金配方顆粒處方和工藝制備缺尿苷、腺苷的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：分別精密吸取供試品（批號為1906001）溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定6次，以腺苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1.00%，相對峰面積的RSD均小于2.00%（n＝6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品（批號為1906001）溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以腺苷峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為1906001）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，以腺苷峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1.00%，相對峰面積的RSD均小于2.00%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

按郁金配方顆粒處方制備15批煎劑。按2.1項下色譜條件進樣測定，15批煎劑HPLC疊加指紋圖譜見圖1。根據(jù)結果，采用Chempattern化學計量學軟件分析數(shù)據(jù)，設樣品（批號為1906001）的色譜圖為參照圖譜，其他樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，即得郁金配方顆粒HPLC對照指紋圖譜，詳見圖2。將15批煎劑的色譜圖錄入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”，確定1號峰為尿苷，3號峰為腺苷，并計算相似度。相似度結果均大于0.85，說明15批煎劑間具有較好的相似性，結果見表1。

2.3.3 樣品相似度評價

圖1 15批標準煎劑高效液相色譜重疊指紋圖譜Fig.1 HPLC overlapping fingerprint of 15 batches of Curcumae Radix standard decoction

圖2 郁金配方顆粒高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Yujin Dispensing Granules

取4批市售樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算相似度。結果，供試品特征圖譜中呈現(xiàn)3個共有峰，并與參照物色譜峰中的保留時間相對應，供試品溶液與對照指紋圖譜相似度均大于0.85。結果見表2。

2.4 指標成分含量測定

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖3。結果陰性對照品溶液色譜中，在與阿魏酸對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關系考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液，制成尿苷／腺苷質(zhì)量濃度分別為26.44／79.26，13.22／39.63，5.09／15.85，3.05／9.51，1.02／3.17，0.51／1.59μg／mL的系列混合對照品溶液。精密量取10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得尿苷和腺苷的回歸方程Y1＝2.3995X1＋4.0551，Y2＝3.216 8X2＋7.689 5，r均為0.999 7（n＝6）。結果表明，尿苷和腺苷進樣量分別在5.1～264.4 ng和15.9～792.6 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

表1 15批煎劑相似度評價結果Tab.1 Similarity of 15 batches of decoction

表2 4個廠家郁金配方顆粒相似度評價結果Tab.2 Similarity of Yujin Dispensing Granules from four manufacturers

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

精密度試驗：取線性關系考察項下第一組混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果尿苷和腺苷峰面積的RSD分別為0.25%和0.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液（批號為1906001）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，18，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果尿苷和腺苷峰面積的RSD分別為1.70%和0.96%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為1906001）適量，精密稱定，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果尿苷和腺苷平均含量分別為0.0463，0.091 2 mg／g，RSD分別為1.50%和1.90%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為1906001，尿苷含量為0.046 5 mg／g、腺苷含量為0.091 1 mg／g）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery tests（n＝6）

2.4.2 樣品含量測定

取4批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果4批樣品中尿苷含量分別為0.043，0.013，0.048，0.035 mg／g，腺苷含量分別為0.098，0.012，0.058，0.058 mg／g。

3 討論

郁金的主要來源為溫莪術根莖或郁金塊莖，浙江是其主產(chǎn)區(qū)。郝敏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種郁金的指紋圖譜具有相似性，其揮發(fā)油指紋圖譜中均含有吉馬酮等化學成分。劉玉紅等［7］建立了4種不同基源的郁金揮發(fā)油指紋圖譜方法，為郁金藥材質(zhì)量標準的制訂提供了依據(jù)。目前，有關郁金含量測定研究主要集中于藥材及其揮發(fā)油的研究，有關郁金配方顆粒中指標成分含量測定鮮有報道。本研究中采用HPLC法，比較不同波長、不同流動相（甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、醋酸-乙腈-水）［8-10］對樣品含量測定結果的影響，最終確定為以甲醇-0.1%磷酸二氫鉀溶液為流動相進行梯度洗脫，測定波長為260 nm。

中藥配方顆粒經(jīng)過多工序加工而成，失去了原有飲片的形態(tài)，在質(zhì)量控制上缺少飲片性狀等重要指標，因此在質(zhì)量控制標準制訂過程中應加強有效成分多元化測定及測定指標多樣化。中藥指紋圖譜屬中藥質(zhì)量控制的新技術，能有效且全面地反映其整體特性。本研究通過15批標準湯劑擬合出對照指紋圖譜，并與市售4批樣品比較，指認3個共有峰，且相似度均大于0.85。

綜上所述，該方法操作簡便、準確，重復性好，結合所建立的指紋圖譜，可為郁金配方顆粒的質(zhì)量評價提供參考。