柴胡安心膠囊揮發性成分氣相色譜串聯質譜指紋圖譜研究*

于 靜，陳 威，張彥景，楊繼章，孫國祥，王玲嬌△

（1.河北醫科大學第一醫院藥學部，河北 石家莊 050031； 2.河北醫科大學藥學院，河北 石家莊 050017；3.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016）

柴胡安心膠囊是醫院院內制劑，有疏肝理氣、鎮靜安神功效，主要組方藥材（如柴胡、白芍、桂枝等）富含揮發性成分，其中柴胡的揮發性成分有解熱鎮痛、保護心血管作用［1］；白芍的揮發性成分如丹皮酚可改善腦缺血再灌注，有抗抑郁、抗焦慮作用［2］；桂枝中肉桂醛的鎮靜、降壓作用顯著［3］。該制劑處方組成中含揮發性成分的藥味超總量的60%，在制劑加工過程中，濃縮液表面可見含香氣的油類物質層，目前對柴胡安心膠囊的研究主要集中于極性部位［4-5］，尚未見對該制劑揮發性成分的詳細研究。數字化指紋圖譜是以數學原理對指紋圖譜的特征進行數據挖掘的數字加工過程［6］，以多數據體現指紋圖譜特征，能全面且整體地反映中藥化學成分的內在質量。本研究中采用氣相色譜串聯質譜（GC-MS）法測定柴胡安心膠囊中揮發性成分，并建立指紋圖譜，為闡明其抗焦慮、抗抑郁作用的藥效物質基礎和基于揮發性成分的質量控制提供科學依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TRACE DSQ型氣相色譜串聯質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Sartorius BS110S型分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

柴胡安心膠囊（河北醫科大學第一醫院，批號分別為170813，170826，170901，170914，170928，170834，170841，170855，170935，170959，170968，規格為每粒0.5 g）；試驗所用試劑均為分析純，水為純化水。柴胡（批號為180601CP254）、白芍（批號為180601CP072）、龍骨（批號為20180101）、夏枯草（批號為20180401）、延胡索（批號為20160901）、炙甘草（批號為20180101），均購自河北新祁有限公司；葛根（批號為18031901）、清半夏（批號為18070701）、珍珠母（批號為18011501）、干姜（批號為18011601），均購自國藥樂仁堂有限公司；桂枝（批號為180601CP252）、茯苓（批號為180601CP212）、牡蠣（批號為180501CP154）、大棗（批號為171201CP611），均購自河北萬修藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5ms毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載 氣 為 高 純 度 氦（純 度≥99.999%）；流速為1.0 mL／min；進樣口溫度為250℃；進樣量為1μL；程序升溫，起始溫度60℃、保持4 min，以5℃／min的速率升至170℃、保持4 min，以5.0℃／min的速率升至280℃，保持10 min；分流比為20∶1（分流進樣）。

質譜條件：電離方式為電子轟擊離子源，轟擊能量為70 eV；離子源溫度為230℃；傳輸線溫度為250℃；溶劑延遲時間為4 min；質荷比（m／z）為55～550。

2.2 供試品溶液制備

取樣品內容物約5 g，精密稱定，加入50 mL正己烷，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理20 min（2次），濾過，合并濾液，濃縮后用正己烷定容至10 mL，上清液4 000 r／min離心10 min，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取供試品溶液（批號為170813）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定6次，以12號峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間的RSD小于0.96%，相對峰面積的RSD小于2.26%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號為170813）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，16，24 h時按2.1項下試驗條件進樣測定，以12號峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間的RSD小于0.87%（n＝8），相對峰面積的RSD小于2.26%（n＝8），表明室溫下供試品溶液在24 h內基本穩定。

重復性試驗：精密稱取藥材樣品（批號為170813）適量，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，以12號峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間的RSD小于0.91%（n＝6），相對峰面積的RSD小于2.91%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.4 GC-MS指紋圖譜的建立及共有峰的指認

指紋圖譜建立：取12批樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，以其中峰面積最大的12號峰為參照峰，確定53個共有峰，將結果導入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0軟件［7］，以平均值法計算生成對照指紋圖譜，詳見圖1。對12批樣品及對照指紋圖譜的GC-MS圖進行擬合，得到GC-MS疊加指紋圖譜，詳見圖2。

圖1 柴胡安心膠囊氣相色譜串聯質譜對照指紋圖譜Fig.1 GC-MS reference fingerprint of Chaihu Anxin Capsules

圖2 12批柴胡安心膠囊氣相色譜串聯質譜疊加指紋圖譜Fig.2 GC-MS superimposed fingerprint of 12 batches of Chaihu Anxin Capsules

整體評價柴胡安心膠囊質量：采用系統指紋定量法［8］，從中藥的整體宏觀定性角度和整體定量角度對其進行量化控制。宏定性相似度（Sm）為雙定性相似度（SF和SF′）均值，計算公式見式（1）；宏定量相似度（Pm）為雙定量相似度（C和P）均值，計算公式見式（2）；α為指紋均化性變動誤差控制系數，計算公式見式（3），據此將中藥質量劃分為8級，詳見表1［9］。質量級別由Sm，Pm，α中級別最低參數決定，3個公式中，n為指紋峰數，xi與yi為各指紋峰的積分面積，γ為指紋信號均化系數。

表1 系統指紋定量法判定依據Tab.1 The evaluation basis of system fingerprint quantitative method

將GC-MS指紋圖譜看作一個系統，用Sm表示指紋的數量和分布比例；用Pm監測指紋的整體含量；用α限定指紋變異范圍。以對照指紋圖譜為標準得12批樣品的Sm，Pm，α值（見表2）。結果顯示，除S1和S2外，其余10批柴胡安心膠囊的Sm均大于0.90，表明各個批次制劑中成分數量和分布比例十分相似，除S2外，其余批次樣品的Pm均大于90，且不同批次樣品含量有差異。根據系統指紋定量法可知，樣品質量極好、很好、中等的分別有5批、5批、2批。

共有峰歸屬和指認：對12批樣品的GC-MS指紋圖譜根據共有峰的保留時間，結合美國國家標準與技術局（NIST）譜庫檢索及文獻檢索［10-15］，并進行對比，共標定53個共有峰，其中44個峰占峰面積的99.57%，故對這44個峰進行鑒定。鑒定出了44種化學成分并確定了歸屬，其中主要包括糠醛（22.50%）、丹皮酚（15.80%）、棕櫚酸（12.33%）、桉葉油醇（4.48%）等，詳見表3。結果表明，揮發性成分多數出自柴胡、葛根、白芍、延胡索、夏枯草、半夏、桂枝藥材（占峰面積的97.15%），上述藥材在組方中的配比超過65%，進一步證實了揮發性成分可能在柴胡安心膠囊的藥效物質基礎中發揮了積極作用。

3 討論

本試驗中采用GC-MS法對柴胡安心膠囊揮發性成分進行指紋圖譜研究，為了更好地反映其揮發性成分，供試品溶液制備過程中，比較了回流法、超聲法、揮發油法的提取率。結果表明，后兩者優于前者，從圖譜結果觀察后兩者結果差異不大，以操作簡便考量，選擇超聲法作為提取方法。并考察了石油醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈等溶劑對提取結果的影響，結果表明，以正己烷為溶劑時提取最完全，色譜圖的峰數最多，干擾成分最少，基線最平，故以正己烷作為提取溶劑。

本試驗采用“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0”軟件，以平均值法計算生成對照指紋圖譜，對12批樣品及對照指紋圖譜的GC-MS圖進行擬合，得GC-MS疊加指紋圖譜，按系統指紋定量法鑒別出12批樣品的不同質量等級。該法與國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A版）”相比，前者以夾角余弦法與相關系數法計算相似度受大指紋峰影響嚴重，不僅掩蓋了小峰貢獻，且不能定量評價，對于小峰突出且有可能為活性成分的指紋圖譜鑒定質量可能導致誤判。本研究中采用的系統指紋定量法，將中藥的指紋整體看作一個系統，應用Sm，Pm，α對中藥指紋量和分布比例、含量、比例變異范圍進行了整體監測，三者結合來控制中藥質量，克服了傳統的中藥指紋圖譜技術的小峰模糊化的缺點。

GC-MS法可用于鑒別藥物的真偽和判斷中藥材及制劑質量的穩定性［16］。相較于液相色譜串聯質譜法，GC-MS法重復性好，化合物裂解圖譜再現性高，具有商品化的譜庫可供檢索，在缺乏對照品的情況下依然是化合物定性分析的有效方法［17］。本試驗中采用NIST譜庫對小分子揮發性成分進行指認，其譜圖結果穩定、可靠。

表2 12批柴胡安心膠囊質量判定結果Tab.2 Quality evaluation results of 12 batches of Chaihu Anxin Capsules

表3 柴胡安心膠囊GC-MS指紋圖譜中44個共有峰指認結果Tab.3 Identification of 44 common peaks in GC-MS fingerprint of Chaihu Anxin Capsules

由藥味歸屬及共有峰指認結果可知，柴胡安心膠囊的指紋圖譜主要反映了柴胡、夏枯草、白芍、延胡索、桂枝這5種藥味的成分，且大都為活性成分。如柴胡中的棕櫚酸可增強免疫力、保護心血管，白芍中的丹皮酚可抗抑郁、抗焦慮，亞油酸可調血脂、軟化血管，夏枯草中糠醛可抗炎、調節免疫，桂枝中肉桂醛可鎮靜、降壓等。通過在指紋圖譜中控制上述成分，可有效評價該制劑的整體質量。

綜上所述，所建立的GC-MS指紋圖譜法簡單、穩定、可靠，可用于柴胡安心膠囊揮發性成分的研究及整體質量控制，也為后續藥效學的研究提供了參考。