人工智能氣候室中靈芝富硒栽培研究

張玉華，張北壯，黃仕祥，何煥清，龔玉蓮，曾碧健，蔡文韜，王 璐

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東 廣州 510303；2.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275；3.廣東省農業科學院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】硒是人體必需的重要微量元素［1］，能夠提高機體免疫力［2-4］和抗氧化能力［5-8］，預防腫瘤等有關疾病發生［9-11］，在抗衰老及作為部分金屬元素的天然解毒劑等方面有重要生理效果［12-13］。缺硒不僅使人的抵抗力下降，還會增加疾病的發生幾率［14-15］。硒主要以無機態和有機態兩種形式存在，不能由機體自主合成，只能從體外攝取，人體攝入的有機硒主要是硒蛋白和硒多糖［16］。對硒鹽的毒理分析表明，無機硒（如硒酸鹽、亞硒酸鹽）的毒性相對較強，機體吸收率較低；而有機硒毒副作用較小，生物利用率高，生理藥理功能也相對優越［17］。【前人研究進展】我國硒資源非常豐富，但均以無機態形式存在，使用范圍和劑量受限。通過人工栽培靈芝將無機硒轉化成有機硒是研究熱點。有關研究表明，靈芝具有極強的富集硒功能，其耐硒能力和生物轉化率比猴頭菌、香菇、金針菇等食用菌高［18］，富硒靈芝是利用生物轉化法研制的一種新的含硒補劑，對人體健康具有重要保健作用。【本研究切入點】目前利用靈芝為載體進行生物富硒的研究中，大多采用液體發酵進行［19-22］，也有少數學者以亞硒酸鹽（亞硒酸鈉）為硒源，采用固體基質栽培的方法進行［23］。開發生物源有機硒是為機體提供硒源的有效途徑，也是目前人工栽培富硒靈芝研究的熱點。【擬解決的關鍵問題】在人工智能氣候室中，以硒礦粉作為硒源進行固體栽培靈芝富硒研究，充分利用硒礦資源，通過靈芝體內轉化為有機硒，篩選固體基質栽培富硒靈芝的條件和較適合的硒濃度，為靈芝商業化栽培和富硒產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 硒源 供試硒源為硒礦粉，來源于湖北恩施，含硒量為50 μg/g。

1.1.2 培養基配方 供試靈芝（Ganoderma lucidum）菌株由廣州中大圣之禾靈芝產業科技園篩選培育。母種培養基配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO4?7H2O 1.5 g、維生素B110～20 mg、瓊脂18～20 g、水1 000 mL、自然pH。培養基經0.14～0.15 MPa滅菌30 min，冷卻備用。

栽培種培養基配方為木屑73%、麩皮25%、蔗糖1%、石膏1%，將上述培養基質充分拌勻后加水，含水量達60%～65%，pH 6.0～6.5，攪拌均勻后裝袋，在100℃滅菌室中滅菌16～18 h，保溫3 h。培養基經滅菌后，冷卻至25℃左右即可在超凈工作臺上按無菌操作規程接種。

1.2 試驗方法

按廣東省食品安全企業標準Q/GDSZH 002-2017 方法，采用分光光度計法測定各試驗處理（表1）孢子粉和子實體的多糖和總三萜含量。按國家檢測標準GB5009.93-2010 方法，采用原子熒光光譜法測定各試驗處理孢子粉和子實體的硒含量。

表1 各處理菌包外源性硒礦粉與硒含量Table 1 The exogenous selenium ore powder and selenium content in bacteria packags of different treatments

1.2.1 栽培條件 試驗在靈芝人工智能氣候室栽培系統中進行［24］，栽培全程采用全熱交換節能控制系統、恒溫系統、新風系統、PM2.5 過濾系統、智能光照系統和超聲波加濕技術等智能化的工業控制手段人工模擬自然生長環境，根據靈芝生長發育習性，在靈芝各生長發育過程給予所需的光質和光照強度、溫濕度、O2、CO2等條件。進入人工氣候室用于栽培的水經過磁化處理，進入培養室的空氣采用PM2.5 過濾系統過濾，為靈芝生長發育提供最適宜的環境條件，確保結果可靠性。

1.2.2 栽培方法 （1）菌絲培育。將已接種的菌包置于25～28℃人工智能氣候室中暗培養30～40 d。當菌絲體長滿菌包時，再將菌包移入人工智能氣候室進行出芝培養。

（2）出芝培養。培養室溫度25～28℃，濕度60%～70%；CO2控制在400～600 μl/L；光照為1 000～1 200 lx。菌包出現子實體原基時濕度提高到85%～90%，且采用促進靈芝子實體原基分化的紅光光照系統處理［25］，給予光譜波長為600～650 nm 的紅光照射7 d，以促進靈芝子實體形成和孢子產生。子實體直徑達到3 cm 時，濕度提高到90%～95%。子實體生長至成熟過程的顏色變化為白→淺黃→黃→紅褐色，當子實體的邊緣白色消失（邊緣變紅）時，表明子實體已成熟，開始噴射孢子，濕度逐漸降至65%～70%。

（3）采收。靈芝孢子噴粉歷時28～30 d，完成噴粉后立即采收，并把收集到的孢子粉用低溫洗滌、真空干燥凈化專利技術［26］進行處理，使靈芝孢子粉的試驗凈度達到100%。靈芝子實體采收后，用清水洗凈切片后在真空干燥室中進行干燥處理。靈芝孢子粉和子實體供試樣本的含水量控制在10%以下。

2 結果與分析

2.1 靈芝孢子粉中硒含量

表2 試驗結果顯示，對照孢子粉的平均單產為9.57 g/菌包，硒含量為0.13 μg/g。處理2 孢子粉的平均單產為9.82 g/菌包，硒含量為1.10 μg/g，與對照相比，硒富集系數為8.5。處理3 孢子粉的平均單產為9.85 g/菌包，硒含量為3.20 μg/g，硒富集系數為24.6。處理4 孢子粉的平均單產為10.56 g/菌包，硒含量為4.40 μg/g，硒富集系數為33.8。處理5 孢子粉的平均單產為9.83 g/菌包，硒含量為6.80 μg/g，硒富集系數為52.3。處理6 孢子粉的平均單產為9.75 g/菌包，硒含量為7.70 μg/g，硒富集系數為59.2。單因素方差分析顯示，各處理間靈芝孢子粉硒含量均存在極顯著差異。LSD 檢驗結果顯示，對照靈芝孢子粉硒含量顯著低于硒礦粉添加處理；處理2 靈芝孢子粉硒含量顯著低于其他處理，在本試驗硒濃度范圍，靈芝孢子粉中的硒含量隨菌包中硒礦粉添加量的增加而提高，兩者呈正相關。

表2 外源性硒礦粉對靈芝孢子粉硒含量的影響比較Table 2 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on selenium content in Ganoderma lucidum spore powder

處理3、4 靈芝孢子粉產量顯著高于對照，處理2、5 與對照和其他處理間不存在顯著差異。可見，在本試驗硒濃度范圍，菌包中添加硒礦粉不影響孢子粉的形成和產量。

2.2 靈芝孢子粉中多糖和總三萜含量

表3 結果表明，對照中每100 g 孢子粉中多糖和總三萜含量與各硒礦粉添加處理差異不顯著。可見，在本試驗硒濃度范圍，菌包中添加硒礦粉不影響孢子粉中多糖和總三萜的合成，不影響其含量。自然條件下，每100 g 靈芝孢子粉中多糖含量約1.8 g，總三萜含量約3.0 g，對照多糖及總三萜含量有大幅度提升，可見人工智能氣候室為靈芝生長發育提供最適宜的環境條件，有利于靈芝孢子粉中多糖和總三萜的合成。

表3 外源性硒礦粉對靈芝孢子粉多糖和總三萜含量的影響比較Table 3 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on polysaccharide and total triterpene contents in Ganoderma lucidum spore powder

2.3 靈芝子實體中硒含量

由表4 可知，對照子實體的平均單產為15.83 g/菌包，硒含量為0.35 μg/g。處理2 子實體的平均單產為14.65 g/菌包，硒含量為1.30 μg/g，與對照相比，硒富集系數為3.7。處理3 子實體的平均單產為15.12 g/菌包，硒含量為5.15 μg/g，與對照相比，硒富集系數為14.7。處理4 子實體的平均單產為15.05 g/菌包，硒含量為10.90 μg/g，與對照相比，硒富集系數為31.1。處理5 子實體的平均單產為14.86 g/菌包，硒含量為16.25 μg/g，與對照相比，硒富集系數為46.4。處理6 子實體的平均單產為15.20 g/菌包，硒含量為17.05 μg/g，與對照相比，硒富集系數為48.7。通過單因素方差分析，各處理靈芝子實體硒含量間存在極顯著差異。LSD 檢驗結果顯示，對照的靈芝子實體硒含量顯著低于其他各處理，硒含量隨菌包中硒礦粉添加量的增加而提高，兩者呈正相關。

表4 外源性硒礦粉對靈芝子實體硒含量的影響比較Table 4 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on selenium content in Ganoderma lucidum fruit body

單因素方差分析結果表明，對照靈芝子實體產量顯著高于處理2，各硒礦粉添加處理間不存在顯著差異。可見，菌包中添加硒礦粉不影響子實體的形成和產量。

2.4 靈芝子實體中多糖和總三萜含量

試驗單因素方差分析結果（表5）表明，對照中每100 g 子實體中多糖和總三萜含量與其他5個處理差異不顯著。可見，在本試驗硒濃度范圍，菌包中添加硒礦粉不影響子實體中多糖和總三萜的合成，不影響其含量。自然條件下，每100 g 靈芝子實體中多糖含量約0.6 g，總三萜含量約1.0 g，對照多糖及總三萜含量有大幅提升，可見人工智能氣候室為靈芝生長發育提供最適宜的環境條件，有利于靈芝子實體中多糖和總三萜的合成。

表5 外源性硒礦粉對靈芝子實體多糖和總三萜含量的影響比較Table 5 Comparison of the effects of exogenous selenium ore ponder on polysaccharide and total triterpene contents in Ganoderma lucidum fruit body

3 討論

硒對人體的重要生理功能越來越為各國重視，許多國家根據本國自身情況，制定硒營養的推薦攝入量。中國營養學會對我國不同人群的硒推薦用量有所不同，預防營養缺乏病人群的日攝入量為50 μg，亞健康保健人群的日攝入量為100 μg，預防癌癥等重大慢性疾病人群的日攝入量為200 μg，治療期間的日攝入量大于200 μg。我國是世界主要硒資源國家之一，已查明的硒蘊藏量占全球硒資源量的1/3，湖北恩施和陜西紫陽是我國兩個高硒區，硒資源較豐富。然而，我國大多數地區屬于“貧硒”地區，根據中國營養學會對我國13 個省市的調查，目前成年人日平均硒攝入量只有30 μg 左右，與推薦用量的最低限度50 μg相距甚遠。靈芝是珍貴的藥食兩用真菌,具有較強的耐硒和富硒能力，富硒靈芝比普通靈芝表現出更好的生物效應，因此富硒靈芝作為利用生物轉化法研制的一種新的含硒補劑對預防疾病和提高機體的健康水平具有極其重要的意義［16-17］。本試驗以硒礦粉作為硒源添加到靈芝固體基質中，起到靈芝生物富硒的作用。本研究表明在靈芝菌包中添加硒5 000 μg，可獲得含硒量為7.7 μg/g的靈芝孢子粉和含硒量為17.05 μg/g 的靈芝子實體，因此成年人在正常飲食條件下，每天食用3 g孢子粉可達到預防硒元素營養缺乏病和日常保健作用。靈芝子實體雖然含硒量較高，但由于木纖維結構不能直接被食用，要經過蒸煮的方法獲得子實體煮出液，而目前對靈芝子實體煮出液含硒量的研究尚無報道。靈芝具有極強的富集硒功能和耐硒能力［18］，在硒濃度很高的基質中其生長發育不會受到抑制。本試驗在固體栽培基質的菌包中加入硒源的最高含量為5 000 μg，遠未達到抑制靈芝生長發育的濃度。下一步將提高硒濃度進行靈芝富硒試驗，以期得到含硒量更高的靈芝子實體和孢子粉產品。

目前靈芝富硒研究大多采用液體發酵的方法［19-20］，液體培養的靈芝菌絲體硒含量較高，且與固體基質栽培子實體相比，發酵生產靈芝菌絲體簡便、快捷、高效，因此采用發酵工程手段對靈芝進行富硒培養被認為是一種發展趨勢，為規模化工業生產打下基礎［21-22］。眾多研究者為提高發酵培養獲得的靈芝菌絲體的產量以及硒含量，在硒源選用、菌種選育及培養條件優化等方面做了很多研究［27］。靈芝中的三萜類成分主要分布在子實體的外周部分，含量隨子實體成熟度的提高而遞增［28］。大多數品種的靈芝在菌絲體生長發育期間僅形成三萜化合物的前體，而具有生物活性的三萜類化合物隨子實體的生長發育才生成。子實體顯蕾期三萜含量較低，成熟期含量最高［29］，菌絲體及發酵液中三萜類化合物的數量和種類均較少［30］。為獲得富硒且富含三萜化合物的靈芝子實體和孢子粉，采用以硒礦粉作為硒源進行固體基質栽培靈芝是一種切實可行的方法。此方法既可充分利用硒礦資源，又可降低生產成本，對靈芝富硒栽培的推廣與應用具有積極意義。

4 結論

本研究以硒礦粉為硒源加入到靈芝固體栽培基質中，探討靈芝孢子粉和子實體富集硒的作用，以及對孢子粉和子實體產量、多糖和總三萜含量的影響。6 個試驗處理中，每個靈芝菌包的加硒量分別為0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μg，產出孢子粉中硒的富集系數分別為1、8.5、24.6、33.8、52.3、59.2，產出子實體中硒的富集系數分別為1、3.7、14.7、31.1、46.4、48.7。試驗結果表明靈芝孢子粉和子實體中硒的富集系數隨菌包中硒的加入量增加而提高，兩者呈正相關。在6 個試驗處理中，靈芝孢子粉、子實體的產量以及多糖、總三萜的含量差異不顯著。研究結果表明，在本試驗的硒濃度范圍內靈芝富硒栽培不影響孢子粉、子實體的形成和產量，孢子粉、子實體中多糖和總三萜的含量也不受影響。