巨菌草根際土壤微生物群落代謝功能多樣性分析

翁志強，許鈺瀅，呂正陽，劉 娟，王 哲，蔡楊星，王榮波，葉文雨

（1.福建農林大學國家菌草工程技術研究中心/福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.福建省農業科學院植物保護研究所，福建 福州 350002）

【研究意義】土壤微生物是土壤生態系統的分解者和土壤有機質循環的主要動力，它參與土壤養分轉化和循環過程，是土壤生態系統的重要組成部分，在植物養分供應和生長過程中發揮重要的作用［1-3］。土壤微生物分解有機質，增加土壤養分，為植物的生長提供養分。同時，土壤微生物對土壤理化性質也有一定的影響。所以土壤微生物的數量種類與土壤肥力的高低具有一定的聯系［4-5］。巨菌草（Pennisetum giganteumJUJUNCAO）隸屬禾本科狼尾草屬（Pennisetum），是福建農林大學林占熺教授引進并選育的一類草本植物，巨菌草是致富草、治沙草、脫貧草、友誼草，已經幫助一些非洲國家突破了農業發展瓶頸。巨菌草具有廣泛用途，如食藥用菌栽培、飼養牛羊、防風固沙、生物質能源制備、造紙等，對其根際土壤展開土壤微生物群落的功能多樣性的研究，有助于對其進行更為合理的種植與利用［6-12］。【前人研究進展】土壤微生物群落在植物的生長過程中發揮著重要的作用，土壤微生物促進植物的生長，植物為土壤微生物提供營養。Biolog-ECO 微平板具有31 種碳源，96 孔板3 次重復，根據微生物對不同碳源的利用程度來研究土壤微生物的功能多樣性。Biolog 技術是研究土壤微生物群落的功能多樣性的簡單、快速方法之一，越來越多的科研工作者使用該技術。目前，Biolog 技術已經用于植物、果園、油田、礦區等林業、花卉等根際土壤微生物的研究。前人對巨菌草進行了栽培等方面的研究，對巨菌草根際土壤微生物的研究尚未見文獻報道［13-15］。【本研究切入點】將巨菌草根際土作為研究對象，開展其微生物群落功能多樣性的研究，探討適宜巨菌草自然生長的立地條件，為巨菌草及其他植物的生長提供理論依據，以期為更好地經營管理植物提供新的思路和基礎理論基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對平潭試驗基地巨菌草根際土壤與非根際土壤不同碳源利用，揭示根際土壤微生物群落功能的多樣性，促進巨菌草產業化種植，保護生態，同時為巨菌草生態治理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤樣品采自福州平潭實驗基地巨菌草根際土與非根際土壤。土壤為砂質土壤，保水性能差，保肥性能弱。

主要儀器設備：酶聯免疫檢測儀SpectraMaxi3（美谷分子儀器（上海）有限公司）、八通道移液器（Eppendorf AG）、Biolog-Eco 生態板（美國Biolog 公司）、生化培養箱（寧波海螺賽福實驗儀器廠）、UNIQUE-R20 純水機（銳思捷科學儀器有限公司）、超凈工作臺ZHJH-C1214B（廈門德維科技有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品的采集 在每塊樣地內以S 型采樣法選取5 個采樣點，用土鉆采集根際土和非根際土壤樣品，混合后裝入已滅菌的土壤袋中，帶回實驗室后1 d 內進行分析［16］。

1.2.2 巨菌草根際土及其對照土壤微生物群落多樣性分析 采用Biolog-ECO 技術對土壤微生物群落功能及代謝多樣性進行分析，利用酶標儀在590 nm 波長下進行測定和數據讀取，分析其多樣性，3 次重復。生態板31 種碳源分為6 類：羧酸類7 種、多聚合物類4 種、糖類10 種、酚類2 種、氨基酸類4 種、胺類2 種。具體方法：稱取10 g 新鮮根際土壤，加入盛有100 mL、0.85%NaCl 溶液的三角瓶中，搖床280 r/min，振蕩30 min，取出后冰浴靜置2 min，用0.85% NaCl溶液梯度稀釋至1 000 倍。用移液器將上述稀釋液加入Biolog-Eco 微平板中，每孔加150 μL，25 ℃恒溫培養，每隔24 h 使用酶標儀讀取數據，共記錄7 d［17］。

將每次讀板得到的吸光值減去對照（培養0 h）孔的吸光值，以去除本底干擾，負值全部歸0。分別計算31 個孔中碳源的平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）和培養144 h 的數據進行土壤微生物多樣性分析。

式中，C 為生態板中微孔的吸光度值（590 nm），R 為生態板中空白對照孔的光密度值，n 為底物數量（Eco 板，n=31）。

Shannon-Wiener 多樣性指數、Simpson 優勢度指數、Pielou 均勻度指數等采用DPS（7.05）軟件進行數據處理與分析。以培養144 h 的數據進行碳源代謝和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物群落平均顏色變化率（AWCD）

AWCD 值反映了巨菌草根際土壤樣品中微生物群落對碳源利用的整體情況和代謝活性。分別培養巨菌草根際土壤及其對照的微生物在0、24、48、72、96、120、144 h 共7 個時段的碳源利用情況，巨菌草根際土壤及其對照的微生物對碳源利用在144 h 后趨于平緩。從圖1 可以看出，無論是巨菌草根際土壤還是其對照土壤，微生物群落在0～48 h 時段對碳源的利用最低，在144 h對碳源的利用趨于平緩，因此選擇144 h 的吸光值作為計算微生物群落多樣性的指標值。巨菌草根際土壤AWCD 值明顯高于對照土樣品，說明巨菌草根際土壤微生物對碳源的利用程度大于對照土壤。

圖1 巨菌草根際土壤與非根際土壤微生物碳源利用Fig.1 Carbon source utilization of microorganisms in rhizophere and non-rhizosphere soils of Pennisetum giganteum

2.2 巨菌草根際土與非根際土壤微生物群落功能多樣性分析

Shannon 多樣性指數是均勻度和豐富度的綜合指標，Simpson 多樣性指數值越大，表示多樣性程度越高，Shannon 多樣性指數值越大，表示群落多樣性越大。由表1 可知，巨菌草根際土壤的Simpson 優勢度指數、Shannon-Wiener 多樣性指數、Brillouin 多樣性指數、Pielou 均勻度指數比非根際土壤略大，表明巨菌草根際土壤微生物的群落多樣性程度高。

表1 巨菌草根際土壤及其對照土壤微生物群落多樣性指數Table 1 Diversity indexes of microbial communities in rhizophere and control soils of Pennisetum giganteum

2.3 根際土壤微生物群落利用碳源情況

表2 為巨菌草根際土與非根際土壤樣品144 h 各類碳源利用情況。巨菌草根際土壤微生物群落不能利用的碳源有L-蘇氨酸、2-羥基苯甲酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸、α-D-乳糖、1-磷酸葡萄糖等碳源，其非根際土壤不能利用的碳源有腐胺、1-磷酸葡萄糖等碳源。

表2 巨菌草根際土壤及其對照土壤微生物對BIOLOG-Eco 板上碳源的利用情況Table 2 Vtilization of Carbon sources on BIOLOG-Eco plate of microorganisms in rhizophere and control soils of Pennisetum giganteum

2.4 土壤微生物群落利用碳源主成分分析

運用SPSS19.0 軟件采取降維的方法，基于培養144 h 的AWCD 值進行樣品土壤微生物利用碳源的主成分分析。

PCA1 解釋變量方差的54.727%，PCA2 解釋變量方差的45.273%，說明PCA1 對群落的貢獻略大。第一主成分與第二主成分貢獻率之和達到100%，說明提取的PCA1 和PCA2 主成分可以反映土壤微生物對6 類碳源的利用情況（表3）。

表3 巨菌草根際土壤及其對照土壤微生物群落碳源利用主成分分析Table 3 PCA on carbon source utilization of microbial communities in rhizophere and control soils of Pennisetum giganteum

31 種碳源對PC1 和PC2 貢獻的特征向量系數反映了單一碳源對PC1 和PC2 的貢獻（圖2）,由圖2 可知,對PC1 貢獻大的碳源（系數＞0.50）有22 種,其中糖類8 種（β-甲基-D-葡萄糖苷、D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸γ-內酯、1-磷酸葡萄糖、α-D-乳糖、D-甘露醇、D-木糖、N-乙酰-D 葡萄糖氨），羧酸類占5 種（D-蘋果酸、D-葡糖胺酸、衣康酸、D-半乳糖醛酸、γ-羥丁酸），氨基酸類3 種（L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-天門冬酰胺），多聚物3 種（吐溫40、吐溫80、α-環式糊精），胺類2 種（腐胺、苯乙胺），酚酸類1 種（4-羥基苯甲酸）。可見影響PC1 的主要為糖類和羧酸類；對PC2 貢獻大的碳源有7 種,其中酚酸類2 種（2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸）,糖類1 種（D-纖維二糖），氨基酸類3 種（L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸）。可見影響PC2 的主要為氨基酸類。4-羥基苯甲酸和L-苯丙氨酸對PC1 和PC2 貢獻系數都＞0.50。

圖2 31 種碳源對PC1 和PC2 貢獻的特征向量系數Fig.2 Eigenvector coefficients of 31 carbon sources with loadings for PCA1 and PCA2

3 討論

巨菌草具有獨特生態功能，根際微生物群落對其生長發育及環境適應性密切相關。Biolog-Eco技術是研究土壤微生物多樣性的技術手段之一，采用該技術研究菌草根際土壤微生物群落功能多樣性，有助于探尋巨菌草最適生長條件。環境條件、植被、土壤肥力、物質循環和能量轉化都與土壤微生物的活性有極大的相關性，土壤微生物是土壤物質循環的主動力［20-24］。在利用Biolog-Eco生態板技術研究土壤微生物群落代謝活性時，如果 AWCD（平均顏色變化率）值越高，說明土壤微生物群落代謝活性就高，反之，說明其微生物群落代謝活性低［25］。本研究中，巨菌草根際土壤各時段的AWCD 值均高于非根際土壤，這表明巨菌草根際土壤微生物的代謝活性高于非根際土壤，同時也說明對碳源的利用程度也高于非根際土壤。一方面由于巨菌草植株高大，根系發達等特點，為土壤微生物創造了良好的生存環境，有利于土壤微生物群落多樣性和功能多樣性的形成。但是巨菌草根際土壤微生物活性的提高是否會影響巨菌草及其他植物的生長發育、產量及品質也未做相關研究。哪一類微生物對巨菌草的影響是顯著的也是值得進一步的研究。

土壤微生物對不同碳源利用能力的差異可以在一定程度上指示土壤微生物的群落結構組成［26］。本實驗碳源利用分析結果表明，巨菌草根際土壤微生物群落能利用六大類（糖類、多聚物類、氨基酸類、羧酸類、胺類和酚酸類）碳源，其生理活性高于非根際土壤，提高了對碳源的利用。這可能是由于巨菌草植株殘體為土壤微生物群落提供了豐富的營養，進一步造成了土壤微生物生境不同，進而造成微生物群落利用碳源的不同，這種解釋有待于進一步用培養基培養法分離微生物進行驗證。

平潭菌草試驗基地地處沙漠區，種植菌草后沙漠變綠洲，這在一定程度上改善了當地的生態環境條件。土壤微生物多樣性指數比較分析表明，巨菌草根際土壤微生物的Pielou 指數、Shannon指數、Brillouin 指數高于非根際土壤，但差異不顯著。這可能是由于植物根系分泌物不同所致。巨菌草根際土微生物群落結構和優勢微生物的種類，還有待通過高通量測序技術、PLFA 等技術進行進一步研究。

4 結論

本研究通過Biolog-ECO 技術分析巨菌草根際土壤微生物群落代謝功能多樣性，結果表明，巨菌草根際土壤微生物群落具有較高的AWCD 值，巨菌草根際土壤微生物群落的碳源代謝能力大于非根際土壤。巨菌草根際土壤微生物群落的代謝功能強于非根際土壤。L-蘇氨酸、2-羥基苯甲酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸、α-D-乳糖、1-磷酸葡萄糖等碳源巨菌草根際土壤微生物群落不能利用。應用培養基培養法研究土壤微生群落時，應優先考慮不能利用的其他碳源。巨菌草根際土壤微生物的活性及多樣性均比非根際土壤高，該研究結果為巨菌草的合理種植、生態治理與土壤改良及提高產量的研究提供理論依據。