辣椒炭疽菌干熱處理技術(shù)研究

程喚奇，駱清蘭，鄭小玲，楊玲麗，孫 丹，刁永朝，胡茂林

（1.深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心，廣東 深圳 518055；2.深圳市植物保護與土壤肥料行業(yè)協(xié)會，廣東 深圳 518055；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，北京 100193）

【研究意義】辣椒引入我國至今已有400多年的歷史，現(xiàn)已成為我國栽培面積第二、經(jīng)濟效益第一的蔬菜作物，是我國蔬菜的核心產(chǎn)業(yè)之一［1］。辣椒炭疽病是辣椒上一種普遍發(fā)生的真菌性病害，其病原菌種類較多，屬于類別復(fù)雜、種類繁多的子囊菌門炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）。辣椒炭疽病主要為害辣椒果實和葉片，也可侵染莖部，通常其病果率在10%左右，嚴(yán)重時可高達30%～40%［2］，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和效益。【前人研究進展】不同地區(qū)辣椒炭疽病的主要病原菌有所不同，其中分布較為普遍的是平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）［3-4］。這兩種炭疽菌對辣椒果實均具有很強的致病性。由C.acutatum引起的辣椒炭疽病是近年來出現(xiàn)的新病原物，具有很強的寄主專化性，能夠危害辣椒、草莓、芒果等果實，相比于C.truncatum，其具有更強的致病性與藥劑耐受力［5-8］。辣椒炭疽菌可進行種子傳播，通常以分生孢子形態(tài)附著于種子表面或菌絲體潛伏在種子內(nèi)越冬［9］。辣椒種子作為炭疽菌初侵染源之一，如何從種子源頭遏制該病菌的侵染尤為重要。目前針對辣椒炭疽病的防治方法主要以化學(xué)防治為主，但是化學(xué)藥劑的過度使用易產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，破壞生態(tài)平衡［10］。【本研究切入點】已有的種子熱處理相關(guān)研究表明，通過種子干熱處理，可有效抑制病害的發(fā)生，同時有助于種子解除休眠，提高種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率［11］。播種前采用非化學(xué)防治技術(shù)對辣椒種子進行熱處理可以大規(guī)模、安全、有效地防治種傳真菌性病害的發(fā)生［12］。相比于化學(xué)藥劑處理，通過對辣椒種子進行干熱處理可以減少辣椒炭疽病對植株和果實的危害，且更加安全無污染，減輕對自然環(huán)境帶來的不良影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】當(dāng)前，國內(nèi)外關(guān)于辣椒種子攜帶炭疽菌熱處理技術(shù)研究鮮有報道。基于此，本研究圍繞辣椒炭疽菌的主要優(yōu)勢種平頭炭疽菌（C.truncatum）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）在離體條件下進行熱處理，同時結(jié)合帶菌種子干熱處理效果，綜合評價熱處理后病原菌的生長速率、孢子萌發(fā)抑制率、辣椒種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率等指標(biāo)，探究辣椒種子攜帶炭疽菌的干熱處理方法，從而為蔬菜種子帶菌干熱處理（尤其是炭疽菌的處理）提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 平頭炭疽菌Ct wc 57 菌株和尖孢炭疽菌H-2 菌株均由深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心植檢種子健康實驗室分離獲得。

1.1.2 供試種子 永優(yōu)219 辣椒種子由深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心于2019 年11 月從種子經(jīng)營門店抽樣獲取，種子含水量為5.02%。

1.1.3 培養(yǎng)基 水瓊脂培養(yǎng)基（Water Agar，WA）：瓊脂粉14 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃、21 min 高壓滅菌后備用；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉14 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃、21 min 高壓滅菌后備用。

1.1.4 儀器設(shè)備 WHTM-225A 恒溫恒濕箱、ZQTY-70F 恒溫?fù)u床、ZEIWAT GR60DF 全自動高壓滅菌鍋、海博特FH-1 200 探入式植物培養(yǎng)箱、ZEISS AXIO 生物顯微鏡、徠卡DM i8 倒置顯微鏡、奧豪斯MB120 水分測定儀、種子發(fā)芽盒、20 mL玻璃試管。

1.2 試驗方法

1.2.1 炭疽菌菌絲干熱處理 分別設(shè)置溫度50、52、55、60 ℃及處理時間1、2、4、8 h，共16個處理，以不做任何處理為空白對照。

將在PDA 培養(yǎng)基中28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d的平頭炭疽菌Ct wc 57、尖孢炭疽菌H-2 分別進行上述干熱處理，每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)處理后轉(zhuǎn)板培養(yǎng)4 皿，沿?zé)崽幚砗蟮牟【溥吘壧羧≈睆? mm 的菌絲塊置于PDA 平板培養(yǎng)基中，并在28 ℃恒溫黑暗條件下倒置培養(yǎng)7 d，測量并記錄菌絲體的生長直徑［13］。

1.2.2 炭疽菌孢子干熱處理 設(shè)置溫度為50 ℃，時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、1 h、2 h，共6 個處理，以不做任何處理的孢子為空白對照。

炭疽菌液體培養(yǎng)5 d 后，分別收集平頭炭疽菌Ct wc 57 和尖孢炭疽菌H-2 孢子懸浮液，將濃度統(tǒng)一調(diào)節(jié)至孢子含量為1.66×106CFU/mL；用移液槍吸取5 mL 混合均勻的孢子懸浮液于無菌試管后置于恒溫恒濕箱內(nèi)按上述條件進行干熱處理，每個處理3 次重復(fù)。經(jīng)干熱處理后取出置于室溫，在超凈工作臺中分別吸取100 μL 孢子懸浮液于WA 平板培養(yǎng)基中涂板。

將接種有炭疽菌孢子的WA 平板培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1 d 后用徠卡DM i8 倒置顯微鏡觀察孢子萌發(fā)。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)觀察10 個視野，每個視野內(nèi)孢子數(shù)量不少于20 個孢子，即每個處理隨機調(diào)查統(tǒng)計不少于600個孢子的孢子萌發(fā)數(shù)量。

1.2.3 辣椒種子干熱處理 設(shè)置溫度55 ℃處理1、2、4、8 h，60 ℃處理1、2、4、8、16、24 h，66 ℃處理8、16、24 h，68 ℃處理8、16、24 h，共16 個處理，以不做任何處理為空白對照；每個處理隨機挑取辣椒種子400 粒，設(shè)置4 個重復(fù)，每個重復(fù)100 粒，將隨機挑取的辣椒種子置于恒溫恒濕箱中進行辣椒種子干熱處理。

將干熱處理之后的13 批辣椒種子及未做任何處理的對照種子根據(jù)GB/T 3543.4《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》（1995）［13］進行發(fā)芽試驗。具體操作方法：將種子均勻擺放于鋪有2 層濕潤發(fā)芽紙的19 cm×13 cm×8 cm 發(fā)芽盒中，100 粒/盒，并置于探入式植物培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃、70% RH條件下黑暗培養(yǎng)至種子露白后12 h 黑暗/光照交替培養(yǎng)，于生長期7、14 d 分別調(diào)查統(tǒng)計種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率。

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對照孢子萌發(fā)數(shù)-熱處理孢子萌發(fā)數(shù)）/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100

發(fā)芽勢（%）=第7 d 正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

發(fā)芽率（%）=第14 d 正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2003 進行極差分析整理，采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行差異顯著性分析，采用Graph Pad Prism 5 數(shù)據(jù)處理軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干熱處理對辣椒炭疽菌菌絲體的影響

通過對平頭炭疽菌和尖孢炭疽菌菌絲體進行不同干熱處理，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7 d 后的菌落直徑存在差異（圖1、圖2），菌落直徑隨著干熱處理溫度的增加及時間的延長而減小。其中，平頭炭疽菌50 ℃處理2 h 及52、55、60 ℃處理1 h 后病原菌處于失活狀態(tài)（圖1、圖2）；尖孢炭疽菌50 ℃處理4 h、52 ℃處理2 h 和4 h 及55 ℃和60 ℃處理1 h 后病原菌處于失活狀態(tài)（圖1、圖3）。

圖1 不同干熱處理平頭炭疽菌和尖孢炭疽菌的生長速率Fig.1 Growth rate of Colletotrichum truncatum and Colletotrichum acutatum under different dry heat treatments

圖2 不同干熱處理平頭炭疽菌菌落生長形態(tài)Fig.2 Morphological characteristics of Colletotrichum truncatum colony under different dry heat treatments

圖3 不同干熱處理尖孢炭疽菌菌落生長形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of Colletotrichum acutatum colony under different dry heat treatments

2.2 干熱處理對辣椒炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

平頭炭疽菌和尖孢炭疽菌孢子懸浮液分別進行不同干熱處理，經(jīng)固體培養(yǎng)1 d 后孢子萌發(fā)率差異顯著。兩種病原菌孢子萌發(fā)抑制率分別隨著干熱處理時間的延長而逐漸增高。平頭炭疽和尖孢炭疽孢子經(jīng)50 ℃處理20 min 后均無萌發(fā)，抑制率均達到100.00%（圖4）。本試驗中，孢子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)是芽管長度達到分生孢子短徑長度1倍的記錄為萌發(fā)［14-15］（圖5）。

圖4 50℃干熱處理炭疽病菌的孢子萌發(fā)抑制率Fig.4 Inhibition rates of spore germination of Colletotrichum after dry heat treatment at 50℃

圖5 炭疽菌孢子萌發(fā)特征Fig.5 Characteristics of Colletotrichum spores germination

綜合2.1 和2.2 干熱處理結(jié)果可以得出，C.truncatum和C.acutatum在55℃、1 h 干熱處理后菌絲及孢子體生長與萌發(fā)完全受到抑制，為最佳的干熱處理條件。

2.3 干熱處理辣椒種子活力測定

對辣椒種子永優(yōu)219 進行不同干熱處理后的發(fā)芽勢及發(fā)芽率進行測定，結(jié)果（表1）表明：在55～66 ℃、1～24 h 處理區(qū)間內(nèi)發(fā)芽勢和發(fā)芽率與CK 相比差異不顯著；在68 ℃處理8、16、24 h 后發(fā)芽勢和發(fā)芽率與CK 相比差異顯著，經(jīng)16 h 和24 h 處理后辣椒種子萌發(fā)完全受到抑制。

表1 干熱處理辣椒種子的發(fā)芽勢與發(fā)芽率Table 1 Germination potential and germination rate of pepper seeds after dry heat treatment

以上結(jié)果表明，在溫度55～66 ℃、1～24 h 處理區(qū)間內(nèi)即可完全抑制C.truncatum和C.acutatum離體菌株生長，且不影響辣椒種子正常出苗。

3 討論

真菌性種傳病害是由于種子表面或者種子內(nèi)部攜帶相應(yīng)的病原真菌所引起，種子帶菌通常可以作為植物病害傳播的初侵染源造成作物大面積發(fā)病，從而嚴(yán)重影響經(jīng)濟收益［13］。辣椒種子攜帶的不同種類炭疽病菌對干熱處理的溫度和時間敏感程度略有差異，在50 ℃下，C.truncatum和C.acutatum離體菌株分別處理2 h 和4 h，菌絲和孢子體抑制率達100%，在55 ℃處理1 h 后菌絲和孢子體生長抑制率均達到100%；田間耕作需要大批量制種時，為了節(jié)省時間成本，選取55 ℃、1 h 進行干熱處理較為適宜。

種子干熱處理作為一種安全有效的種子處理技術(shù)在生產(chǎn)上應(yīng)得到廣泛的推廣和應(yīng)用，干熱處理后的辣椒種子可以增強種皮的通透性，提高發(fā)芽速度，有利于培育壯苗［16］。但應(yīng)注意的是，種子干熱處理要在其安全范圍內(nèi)進行，過高的溫度或者過長的時間都會對種子活力產(chǎn)生影響［17-18］。針對永優(yōu)219 辣椒種子進行不同條件干熱處理后發(fā)現(xiàn)，在55～66 ℃、1～24 h 處理區(qū)間內(nèi)可有效提高辣椒種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率。有研究表明，辣椒種子在40、50、60、70、80 ℃烘干8 h后直接置床可明顯提高種子發(fā)芽勢，對發(fā)芽率無影響；烘干后浸種8 h 再置床處理明顯影響發(fā)芽率［19］。這與本研究處理的溫度和時間差距較大，本研究干熱處理時間和范圍靈活度較高，對辣椒種子活力無影響，更可有效提高其發(fā)芽勢和發(fā)芽率，因此更有利于應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中。Jiyum 等也結(jié)合生物防治和溫湯浸種的方法對種傳病害進行處理，得到的處理結(jié)果與單獨進行干熱處理的效果相差不大［20-21］。

本研究主要針對C.truncatum和C.acutatum兩種離體炭疽菌和健康辣椒種子進行不同條件的熱處理，以篩選出適用于可抑制菌株生長和促進種子萌發(fā)的干熱處理條件，為攜帶炭疽菌的辣椒種子干熱處理提供參考依據(jù)，該處理技術(shù)在辣椒種植過程中的田間應(yīng)用效果還有待進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究基于辣椒炭疽菌優(yōu)勢種平頭炭疽菌和尖孢炭疽菌及健康辣椒種子干熱處理條件進行試驗，同時對比分析了在不同熱處理條件下菌絲及孢子體生長狀況和種子芽勢、芽率生長狀況。試驗結(jié)果表明，在溫度55～66 ℃、時間1～24 h 干熱組合處理區(qū)間可為蔬菜種子帶菌干熱處理提供參考依據(jù)。