居延海東西湖大鰭鼓鰾鰍線粒體COI基因測序分析

高 杰 ，繆麗梅 ，宗振東 ，羅旭光 ，王哲奇 ，紅 海 *

（1.內蒙古自治區水產技術推廣站，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古農業大學，內蒙古 呼和浩特010010）

居延海位于內蒙古阿拉善盟額濟納旗，在巴丹吉林沙漠的北部邊緣，曾是西北地區最大的湖泊之一。流入居延海的黑水河、金額濟納河發源于祁連山。清代后居延海分為東西兩個湖泊，東居延海又叫蘇泊淖爾，西居延海又叫嘎順淖爾。1961年西居延海干涸，1992年東居延海干涸，大鰭鼓鰾鰍由此消失于此區域。2003年黑河改水工程后居延海又正式蓄水，使得大鰭鼓鰾鰍在居延海重新出現。

大鰭鼓鰾鰍 (Hedinichthysyarkandensis macroptera)是居延海特有的鰍科(Cobitidae)條鰍亞科(Nemacheilinae)鼓鰾鰍屬(Hedinichthys)魚類[1]。 目前，國內外學者對大鰭鼓鰾鰍的資源狀況、生態特性、生物學特性、人工繁殖技術以及種群特征等方面進行了相應的研究[1-3]，但有關大鰭鼓鰾鰍的遺傳多樣性等方面的研究鮮有報道。遺傳多樣性可為遺傳育種和物種進化提供遺傳基礎,遺傳背景的調查分析對于物種的有效保護和合理利用至關重要[4]。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因其母性遺傳、無重組等特性，是研究近緣物種遺傳多樣性的理想分子標記。線粒體COI(cytochrome oxidase subunit I)基因為位于線粒體DNA上的蛋白質編碼基因，已廣泛應用于物種鑒定和群體遺傳學等方面的研究[5-8]。為了深入了解居延海大鰭鼓鰾鰍種質資源的遺傳背景，此研究通過PCR擴增和測序，分析大鰭鼓鰾鰍mtDNA COI基因的遺傳多樣性，為該魚在分子生物學的系統進化和多樣性研究及合理開發和利用提供了初步科學依據。筆者及團隊于2018年7月初對居延海東西湖大鰭鼓鰾鰍進行了系統采樣工作，以期通過線粒體COI基因測序分析，對居延海東西湖兩水域的大鰭鼓鰾鰍的基因關系進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

2018年7月3日采集于內蒙古阿拉善盟額濟納旗居延海的52尾大鰭鼓鰾鰍，其中東湖水域和西湖水域各采集26尾，標本采集后經形態學測量及稱重后編號，活體解剖取其背部肌肉置于95%的乙醇溶液中，并在-20℃冰箱中保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和鑒定。將保存于95%乙醇中的標本組織取出，置于無菌蒸餾水中浸泡3 h以上，徹底除凈乙醇；用組織勻漿儀將其打碎，取約100 μg勻漿后的組織，采用promega Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取基因組DNA。提取的基因組DNA，用微量紫外分光光度計測量O.D.260/280比值以及DNA濃度。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和純度。

1.2.2 引物設計。根據文獻設計擴增COI區域的引物，序列如下：

L5956-COI:5'-CACAAAGACATTGGCACCCT-3'

H6558-COI:5'-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3'

1.2.3 PCR擴增和序列測定。基因擴增使用Takara Premix PrimeSTAR HS，反應總體積50 μL，包括：PCR Premix 25 μL，上下游引物各 2 μL，模板 1 μL，補充滅菌水至50 μL。PCR反應條件如下：95℃預變性5 min，然后重復25個循環包括95℃變性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸80 sec，最后72℃延伸7 min。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠成像儀下將擴增良好的條帶進行切膠回收，用天根DP209-03柱式膠回收試劑盒純化PCR產物。純化后的PCR產物送至吉美公司進行測序。

1.2.4 數據處理。測定的DNA序列進行人工校正，采用DNAMAN(Version 5.2.2)軟件進行個體和各魚群間的序列比對，分析Cytochrome oxidase subunit I(COI)基因序列的核苷酸其堿基的組成、位點變異；用MEGA[10](Version 5.1)軟件的 Maximum Likelihood方法進行系統進化樹、遺傳距離和GC含量等分析。利用DANsp v5[9]軟件分析基因多態性及單倍型。

2 結果和分析

2.1 COI基因PCR擴增結果

本項目對52個標本的COI基因進行了序列測定，得到了全部標本的長度為645 bp左右的COI基因序列，擴增的凝膠電泳結果見圖1。

圖1 COI基因PCR擴增結果圖

2.2 COI基因序列特征分析

2.2.1 GC含量分析。645 bp左右的COI基因PCR擴增產物的測序結果經過校對和拼接后，同源排序得到52個魚標本的同源基因序列626 bp。用DNA MAN、MEGA軟件分析同源序列，得到52個標本的同源基因片段GC堿基平均含量為41.70%，每個標本的GC含量詳見表1。

表1 52個標本COI基因的GC含量

結果顯示，52個標本COI基因的GC含量相當，無明顯差異。

2.2.2 變異分析。52個標本的所有626 bp同源基因序中，突變總數7個，存在多態性位點/突變位點7個，單倍型數目為6，單倍型多樣性（HD）為0.622，核苷酸的多樣性（PI）為 0.00147。

2.3 魚遺傳多樣性和遺傳分化

2.3.1 系統進化分析。由圖2可見，52個標本的COI系統進化樹彼此之間的遺傳距離相差不大，說明52個標本的COI基因彼此之間差異不大。從圖3可以看出，52個標本的Cytb基因分布在兩個大的分支上，不同的標本在系統進化樹上分布較散，表明不同標本Cytb基因正在逐步進化。從系統進化分析顯示，D37、D43單獨形成1個分支，D37與D43之間的遺傳距離較遠，其余50個標本的Cytb基因單獨形成另一個分支；除D37、D43之外的50個Cytb基因為主流進化分支 ， 該 分 支 向 著 D1、D3、D15、D18、D19、D20、D21、D29、D31、D35、D44、D48、D52 進化， 在此基礎上進一步進化到 D4、D7、D13、D27、D30、D39、D45、D47 形成1個小分支（圖3）。系統進化分析結果顯示，COI基因的系統進化樹分支與Cytb基因的進化分支有差異（詳見圖 3）。

圖2 52個標本COI基因的系統進化圖

圖3 52個標本的Cytb基因系統進化樹

2.3.2 遺傳距離計算分析。遺傳距離計算結果顯示，52個標本的COI基因遺傳距離彼此之間相差不大，平均遺傳距離都低于0.006，說明52個標本的COI基因彼此之間親緣關系較近，遺傳距離與系統進化樹的結果一致。

D37與D43之間的平均遺傳距離為0.074，D37與其他 （除D43外的50個）標本的平均遺傳距離為0.037，D43與其他（除D37外的50個）標本的平均遺傳距離為0.077。D43的Cytb基因與其他標本的平均遺傳距離大于D37與其他標本的遺傳距離，表明D43的Cytb基因與其他50個標本的親緣關系比D37與其他50個標本的親緣關系遠；說明D43的Cytb基因向著與其他標本的Cytb基因不同的進化方向進化，這與Cytb基因的系統進化圖是一致的。

3 結論

綜合居延海東湖26個樣本和西湖26個樣本，總計52個個體的COI基因特征、遺傳多樣性和遺傳分化分析顯示，52個標本的COI基因彼此遺傳距離較近，說明居延海東西湖大鰭鼓鰾鰍標本的親緣關系較近。基于Cytb基因的大鰭鼓鰾鰍單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性分別為 0.716和0.0027，有較高的遺傳多樣性。推測大鰭鼓鰾鰍魚種群在經歷過瓶頸效應后，可能伴隨產生了迅速的種群擴張與變異的積累，即提高了單倍型多樣性，但沒有明顯增加核苷酸多態性。

本研究中大鰭鼓鰾鰍Cytb基因序列表現出較高的單倍型多樣性和低水平的核苷酸多態性及遺傳多樣性，而這些魚類近年來都面臨著生存受到威脅的局面，這也從側面說明，大鰭鼓鰾鰍這一特有的魚類品種需要持續加強保護、恢復和開發。

基于Kimura雙參數模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.010，整體來看，單倍型之間的遺傳距離較小，說明大鰭鼓鰾鰍個體之間的基因交流不受限制。這是因為大鰭鼓鰾鰍運動能力較強，個體間基因交流不存在地理隔離限制。

52個標本的Cytb基因特征、遺傳多樣性和遺傳分化分析結果顯示，D43標本的Cytb基因進化方向與其余50個標本的Cytb基因進化方向不同，與其他標本的遺傳距離最遠，說明與其他標本的親緣關系更遠，單獨形成1個進化分支。優勢單倍型的個體適應能力強，擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因其環境適應能力差，擁有的繁殖群體較小，更容易對整個種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此,需要持續加強對其種質資源的評估，加大保護力度，合理開發利用,以保持盡可能多的遺傳多樣性，改善種群遺傳結構，從而增加大鰭鼓醥鰍資源恢復及遺傳復壯的機會。