miR-423-5p在牛肌肉組織中表達(dá)及其靶基因預(yù)測

陳 雯，張偉偉，2，*，邵淑麗，2，付學(xué)鵬，2，黃 鑫，2，李 鐵，2

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

MicroRNA(miRNA)，一種非編碼小分子RNA，其長度普遍為21～25個(gè)堿基。 這種小RNA廣泛存在于各種真核生物中，并具有較高的保守性。miRNA主要通過促進(jìn)靶基因的mRNAs發(fā)生降解或者抑制靶基因的翻譯過程，對轉(zhuǎn)錄后水平具有負(fù)調(diào)控作用[1]。miRNA還參與細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)功能[2-3]。生物體內(nèi)肌肉類型大致可分為心肌、平滑肌和骨骼肌三大類。心肌由成熟的心肌細(xì)胞組成，是心臟中特有的肌肉類型，其肌肉增殖分化能力較低[4]。平滑肌主要分布在血管、消化道、生殖道、呼吸道等組織中。當(dāng)肺動(dòng)脈平滑肌受到炎癥、缺氧、創(chuàng)傷等刺激后，平滑肌細(xì)胞可參與肺血管的重塑[5]。另外有研究表明，胰島素可促進(jìn)小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的增殖[6]，表明平滑肌細(xì)胞具有一定的增殖分化能力。骨骼肌是體內(nèi)活躍度以及可塑性較高的一類組織，約占總體重的40%。骨骼肌形成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及到骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞的增殖、分化和肌管形成[7]。

近年發(fā)現(xiàn)miRNAs在肌肉的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用[8]。當(dāng)血管壁受到損傷時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期開始增殖，在這個(gè)過程中有多種miRNAs參與調(diào)節(jié)該細(xì)胞的增殖與遷移。例如miR-92a通過靶向PTEN、miR-22通過靶向MECP2對血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及遷移進(jìn)行調(diào)控[9-10]。而miR-320d和miR-582則會(huì)促進(jìn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。在骨骼肌細(xì)胞中同樣有大量的miRNAs調(diào)控其生長發(fā)育過程，例如miR-1[12]與miR-206[13]在小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中均下調(diào)HDAC4基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的分化[7-8]；miR-486抑制Pax7表達(dá)加速肌源性分化的進(jìn)程[14]。miR-133通過調(diào)節(jié)SRF[15]、MAML[16]、IGF-1R[17]基因的表達(dá)促進(jìn)肌細(xì)胞增殖；在小鼠成肌細(xì)胞中miR-214既可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖又可以促進(jìn)其分化[18]。miRNAs具有組織特異性。miR-1、miR-206、miR-133在骨骼肌細(xì)胞中特異性表達(dá)[19]。在骨骼肌發(fā)育過程中，miRNA具有階段特異性。miR-133在成年豬的肌肉組織中表達(dá)高于胚胎中的表達(dá)水平；而miR-368、miR-376和miR-423-5p則在新生仔豬中的表達(dá)水平較高[20]。

miR-423是一個(gè)在人、小鼠、豬、牛等物種中相對保守的miRNA，能夠形成miR-423-3p和miR-423-5p兩種成熟序列。miR-423與多種疾病密切相關(guān)，如miR-423-5p可作為反映肝衰竭嚴(yán)重程度的分子標(biāo)志[21]。在子宮內(nèi)膜癌[1]、肝癌[13]、胃癌[22]、大腸癌[23]等細(xì)胞系和動(dòng)物模型中miR-423-3p促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23]。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，miR-423與骨骼肌的生長發(fā)育具有一定的關(guān)系。miR-423與豬的骨骼肌的肌肉增殖、分化以及脂肪形成密切相關(guān)[24]，在豬骨骼肌不同的發(fā)育過程中miR-423-5p呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異，miR-423-5p可以抑制靶基因SRF對肌肉分化進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，并最終調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育[25]。同時(shí)miR-423具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生成的能力[26]，其通過靶向融合同源物的抑制劑最終達(dá)到抑制肌肉的生成的目的[12]。另外隨著C2C12細(xì)胞的分化，miR-423-5p mRNA表達(dá)量呈明顯的上升趨勢[8，27]。這些無一不暗示著miR-423在細(xì)胞生長發(fā)育中具有重要的作用。

然而，miR-423-5p在牛肌肉組織中的表達(dá)及可能的作用尚不明確，因此，驗(yàn)證miR-423-5p在牛肌肉組織中的表達(dá)以及在不同分化天數(shù)的MDSCs中的表達(dá)，預(yù)測存在miR-423-5p潛在結(jié)合位點(diǎn)的靶基因，可為明確miR-423-5p在MDSCs細(xì)胞增殖分化中的作用提供前期的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與組織

牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(MDSCs)由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。骨骼肌、小腸、心臟組織取自黑龍江省雙城市屠宰場健康成年西門塔爾牛，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清和馬血清購自Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd公司。ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。TB Green?Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

利用含有30%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDSCs細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)85%后，更換為含2%馬血清的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化處理，分別分化0、24和72 h，然后分別提取細(xì)胞的總RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA提取以及熒光定量PCR

將牛各組織塊在液氮中充分研磨后進(jìn)行分裝，同樣將分化不同時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行收集與分裝。然后利用Trizol法提取總RNA，并利用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix以及莖環(huán)引物將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后利用TB Green?Premix Ex TaqTM進(jìn)行熒光定量PCR，其反應(yīng)體系為：TB Green Premix ExTaq5 μL，cDNA樣品2 μL，上下游引物各0.5 μL，DEPC-treated H2O 2 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲得每個(gè)樣品的Ct值，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)。所用引物如表1所示。

1.2.3 miR-423-5p靶基因預(yù)測

通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站與miRBase 21.0 (www.miRbase.org)數(shù)據(jù)庫查詢牛miR-423成熟體(miR-423-3p和miR-423-5p)及前體序列(pre-miR-423)相關(guān)信息，然后利用在線軟件TargetScan (http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://www.pictar.org/)預(yù)測可能與miR-423-5p結(jié)合的靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 6將數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-423在牛基因組中的位置及序列信息

為明確miR-423在牛基因組中的相關(guān)信息，本文查詢了NCBI網(wǎng)站以及miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫上公布的牛miR-423(Gene ID: 791045)信息，結(jié)果如圖1所示。miR-423位于牛基因組第19號(hào)染色體的21 238 007～21 238 100 bp處，為內(nèi)含子miRNA。miR-423具有兩種成熟序列分別為bta-miR-423-5p：UGA GGG GCA GAG AGC GAG ACU UU(長度為23 bp)；bta-miR-423-3p： AAG CUC GGU CUG AGG CCC CUC AGU(長度為24 bp)。其前體序列(pre-miR-423)為ATA AAG GAA GTT AGG CTG AGG GGC AGA GAG CGA GAC TTT TCT ATT TTC CAA AAG CTC GGT CTG AGG CCC CTC AGT CTT GCT TCC TAC CCC GCG C(長度為94 bp)，位于NSRP1基因的第一個(gè)內(nèi)含子中。另外miRBase網(wǎng)站顯示，bta-miR-423-5p的表達(dá)豐度明顯高于bta-miR-423-3p，因此選擇bta-miR-423-5p進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-423在各物種的同源性分析

通過查閱NCBI網(wǎng)站上公布的信息發(fā)現(xiàn)，miR-423在人(hsa)、鼠(mmu)、牛(bta)、豬(ssc)、馬(eca)、山羊(chi)等25種物種中普遍存在。選取hsa、mmu、bta等含有miR-423-3p和miR-423-5p兩種成熟序列的14個(gè)物種進(jìn)行比較分析。miR-423在各物種的基因組中的位置見表2。在各物種之間pre-miR-423的同源性達(dá)66.96%(圖2-A)，miR-423-3p同源性為95.83%(圖2-B)，miR-423-5p的同源性為100%(圖2-C)。

表1 bta-miR-423-5p引物序列及內(nèi)參基因引物序列

圖1 miR-423在牛基因組中的位置及序列信息Fig.1 miR-423 related information

表2 miR-423基因信息

續(xù)表2 Continued Table 2

2.3 miR-423-5p在牛肌肉組織中的表達(dá)

為明確miR-423-5p在牛不同肌肉組織中的表達(dá)情況，將提取的RNA利用莖環(huán)熒光定量PCR法對牛miR-423-5p的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，小腸與骨骼肌中miR-423-5p的表達(dá)量明顯高于心臟組織。

2.4 miR-423-5p在牛MDSCs分化過程中的表達(dá)

骨骼肌中含有大量的具有增殖分化潛力的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(MDSCs)，因此進(jìn)一步檢測了miR-423-5p在MDSCs增殖分化中的表達(dá)變化。將MDSCs分別分化0 h(MDSC-P)、24 h (MDSC-D1)和72 h (MDSC-D3)，如圖4所示，隨時(shí)間的延長細(xì)胞分化現(xiàn)象明顯，肌管數(shù)量明顯增加；提取總RNA后采用莖環(huán)熒光定量PCR方法檢測miR-423-5p的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，隨著分化時(shí)間的延長，miR-423-5p的表達(dá)量升高。

2.5 miR-423-5p靶基因預(yù)測

為了研究miR-423-5p在生物體內(nèi)可能的作用機(jī)制，利用在線軟件TargetScan和PicTar查詢可能與miR-423-5p結(jié)合的靶基因。預(yù)測結(jié)果顯示，大約有210個(gè)基因mRNA 的3′ UTR含有bta-miR-423-5p潛在的結(jié)合位點(diǎn)。再次利用TargetScan進(jìn)行靶基因的反向篩選，篩選結(jié)果顯示，在210個(gè)靶基因中有12個(gè)基因含有bta-miR-423-5p的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果如表3所示。

** P<0.01; *** P<0.001.圖5 miR-423-5p在MDSCs分化過程的表達(dá)Fig.5 Expression of miR-423-5p in MDSCs during differentiation

3 討論

miR-423是一種廣泛分布在各物種中的MicroRNA，然而在物種牛中與其相關(guān)的信息尚未見報(bào)道。因此，本文介紹了miR-423-5p在牛基因組中相關(guān)信息，并進(jìn)行了與其他物種間的同源性分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛(bta-miR-423)與人(hsa-miR-423)、鼠(mmu-miR-423)、豬(ssc-miR-423)等14個(gè)物種間的同源性達(dá)66.96%。另外對其兩個(gè)成熟體進(jìn)行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p在各物種中的同源性高達(dá)100%，而miR-423-3p在各物種中的同源性則為95.83%。結(jié)果表明，miR-423無論是前體序列還是成熟體序列均顯示為較高的種間保守性。

表3 miR-423-5p靶基因預(yù)測結(jié)果

miR-423-5p在細(xì)胞的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如在豬骨骼肌中其通過抑制SRF基因的表達(dá)進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化[2]。由于miR-423-5p具有高度的保守性，基于此特性，本實(shí)驗(yàn)檢測了牛肌肉中miR-423-5p的表達(dá)，結(jié)果表明，其在骨骼肌中表達(dá)量明顯高于其他兩種肌細(xì)胞。心臟中的心肌主要由成熟的心肌細(xì)胞組成，而該細(xì)胞具有較低的增殖分化的能力。小腸包括黏膜層和肌層，其中肌層主要由平滑肌細(xì)胞以及未分化的細(xì)胞組成，說明該組織具有一定的增殖分化的能力。眾所周知，骨骼肌中含有大量的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，該細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖分化的能力，結(jié)果顯示，miR-423-5p在骨骼肌中表達(dá)量最高，不難看出其與細(xì)胞的增殖分化存在某種聯(lián)系。有研究表明，在小鼠早期增殖的成肌細(xì)胞中觀察到miR-423-5p出現(xiàn)明顯上調(diào)，在肌源性分化4 d后達(dá)到最高水平[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-423-5p在分化的MDSCs中表達(dá)較高，且隨時(shí)間的延長而升高，推測miR-423-5p可能促進(jìn)MDSCs的分化，但其在細(xì)胞中的具體功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

miRNA的“種子序列”是靶基因mRNA的3′UTR主要的結(jié)合位點(diǎn)，具有一定的調(diào)控作用[28]。為了能夠進(jìn)一步了解miR-423-5p在細(xì)胞中的作用及機(jī)制，利用TargetScan預(yù)測以及反向篩選了可能與miR-423-5p結(jié)合的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牛體內(nèi)有12個(gè)基因mRNA的3′UTR具有miR-423-5p潛在的結(jié)合位點(diǎn)，其中部分靶基因參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程。如血小板反應(yīng)蛋白基因家族成員3(Thbs3)，作為一種細(xì)胞外基質(zhì)分子，THBSs家族成員參與了豬骨骼肌生長發(fā)育過程[29]。Ly6神經(jīng)毒素1(Lynx1)是一種GPI-錨定蛋白。在人肺癌細(xì)胞中，通過siRNAs敲除Lynx1后促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖，而Lynx1過表達(dá)則抑制了細(xì)胞的增殖[30]，這表明Lynx1是一種肺癌生長的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)物(VGF)，一種由神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)的多肽，參與神經(jīng)突的生長和神經(jīng)保護(hù)[31]。在視神經(jīng)細(xì)胞中當(dāng)VGF基因被敲低時(shí)，細(xì)胞的增殖被抑制[32]。WNT基因家族成員9B(WNT9B)，是調(diào)節(jié)祖細(xì)胞增殖與分化平衡的關(guān)鍵因子。當(dāng)細(xì)胞中的Six2被敲低時(shí)，Wnt9b/β-catenin則促進(jìn)其分化[33]。在成年斑馬魚腎臟發(fā)育和再生中Wnt蛋白具有重要作用[34]。這些研究結(jié)果預(yù)示著miR-423-5p可能參與細(xì)胞的增殖分化過程，然而這些靶基因究竟是否能夠與miR-423-5p結(jié)合還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；而這些靶基因在牛骨骼肌中的作用同樣需進(jìn)一步的驗(yàn)證。