精準定時輸精對后備母豬早期胚胎發育與繁殖性能的影響

朱志偉，陳曉宇，于福先，張 樑，黃 菁，王志剛，賴建兵，沈順新，殷文彬，潘建治，*

(1.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021； 2.寧波曠代畜牧科技有限公司，浙江 寧波 315181； 3.浙江欣宏源生態農業有限公司，浙江 青田 313900； 4.安吉正新牧業有限公司，浙江 安吉 313300)

隨著我國養豬業的發展，生豬養殖已步入規模化、集約化、技術化時代。后備母豬是豬場基礎繁殖群的重要種用來源，以往傳統后備母豬補充導入生產費時、費力、周期長、效率低，常常由于后備母豬發情遲緩、情期散亂不準、靜立反應差而導致約30%的后備種群無法種用而作淘汰處理，影響豬場經濟效益[1]。精準定時輸精(fixed timed artificial insemination，FTAI)是通過使用激素人為調控母豬性周期，使之在預定的時間集中發情、排卵和配種的一項繁殖新技術[2-3]，FTAI技術不必對后備母豬進行發情鑒定，只需按FTAI程序在預定時間對后備母豬進行激素處理和配種，可大幅提高后備母豬配種利用率，縮短非生產天數，提高生產與管理效率。20世紀90年代德國與東歐一些國家86%的豬場利用FTAI技術實現了豬場的批次化生產管理[1]；而我國養豬業由于集約化、規模化程度不高，人工授精技術的普及效率不高，繁殖母豬科學管理程度不高等因素，對這項技術的研究與應用尚屬于起步探索階段。本研究主要是探討定時輸精技術對后備母豬早期胚胎發育和主要繁殖性能的影響，為定時輸精技術在我國養豬業中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以自主研發的生長速度快、肉質優的金烏黑豬(暫命名，源于杜洛克與金華地方豬)為材料，選取日齡220～240 d、體重110～120 kg的金烏黑豬43頭、大長二元后備母豬189頭，按試驗方案要求隨機分群。試驗豬要求體況健康，無生殖疾病，飼養管理均按所在養殖場正常飼養方式執行。

試驗處理所需烯丙孕素、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、促性腺激素釋放激素(GnRH)均購買自寧波三生生物科技有限公司(批號：20180302)。

1.2 精準定時輸精程序

參照寧波三生公司推薦的程序，試驗開始投藥前用果汁調教適應2 d，正式投藥為每天15：00后，在喂料之前投藥槍飼喂烯丙孕素20 mg·頭-1，連續飼喂18 d，第19天停藥1 d。第20天09：00給每頭后備母豬肌肉注射PMSG 1 000 IU，第23天17：00每頭后備母豬肌肉注射GnRH 100 μg，第24天17：00對所有后備母豬進行第1次配種，第25天09：00對所有后備母豬進行第2次配種，第26天上午對仍表現靜立反應的母豬補配1次。

1.3 試驗設計

試驗1：金烏后備豬隨機分群，實驗開始后，對照組豬不做任何處理，每天進行發情鑒定，按照常規人工授精配種；定時輸精試驗組后備豬分別于0 h(停喂烯丙孕素)、42 h(肌注PMSG)、122 h(肌注GnRH)靜脈采血5～10 mL，離心分離血清，檢測促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P4)等生殖激素指標。試驗組和對照組分別隨機選擇4頭豬，在第2次配種結束后33 h屠宰雙側輸卵管，沖洗回收早期受精卵，回收到的受精卵分別在PZM-5發育液進行體外培養5～7 d，培養條件：37.5 ℃，5% CO2，5% O2，95% N2，飽和濕度。

試驗2：受試豬為大長后備母豬，試驗開始后，對照組后備豬不做任何處理，每天進行發情鑒定，按照常規人工授精配種；試驗組按精準定時輸精程序操作。為觀測精準定時輸精程序對后備母豬的斷奶仔豬存活情況的影響，試驗時間延長到仔豬斷奶結束。

1.4 妊娠診斷

配種后第28～30天對試驗母豬進行B超診斷，檢查是否受孕。

1.5 數據統計與數據分析

試驗豬血清激素檢測委托杭州金域醫學檢驗所檢測，試驗過程中詳細記錄參繁母豬、發情母豬、入配母豬、妊娠數、分娩數、窩總仔、窩活仔、斷奶數，計算配種率、妊娠率和參繁分娩率。實驗數據先使用Excel 2010進行初步整理，后使用SPSS 22.0進行單因素方差分析，采用Duncan’s進行多重比較和差異顯著性分析，結果使用平均值±標準差表示。

發情率(%)=發情母豬頭數/參繁母豬頭數×100；

配種率(%)=配種母豬頭數/參繁母豬頭數×100；

妊娠率(%)=情期妊娠頭數/參繁母豬頭數×100；

分娩率(%)=分娩母豬頭數/參繁母豬頭數×100。

2 結果與分析

2.1 定時輸精對后備母豬發情生殖激素的影響

精準定時輸精試驗組的母豬于處理0、42、122 h采集的血樣中4種激素測定結果如圖1所示。P4值在0 h至42 h由3.71 nmol·L-1下降至2.71 nmol·L-1，但差異不顯著(P>0.05)，在122 h時P4值下降至2.5 nmol·L-1(P>0.05)，表明停喂烯丙孕素后PMSG處理未對精準定時輸精試驗組母豬血液中的P4水平造成顯著影響(圖1-A)。E2值則在0 h至42 h由80 pmol·L-1顯著(P<0.05)下降至58.3 pmol·L-1；42 h至122 h，E2值極顯著(P<0.01)上升至134.07 pmol·L-1(圖1-B)。FSH值在0 h至42 h由0.05 IU·L-1略增至0.07 IU·L-1(P>0.05)，在PMSG作用下上升到0.09 IU·L-1(P>0.05)，但與42 h時血液中FSH含量相比仍無顯著性變化(圖1-C)。LH值在0 h至42 h由0.09 IU·L-1上升至0.12 IU·L-1(P>0.05)，在PMSG作用下，LH值在122 h又降至0.09 IU·L-1(P>0.05)，呈現先升后降的趨勢，但統計學上未見顯著差異(圖1-D)。

所有數據來自于14次獨立重復試驗結果，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。The data wa based on fourteen independent experiments，the different letter indicated significant difference (P<0.05)，and the same letters meant no significant difference (P>0.05).圖1 停喂烯丙孕素后不同時間檢測血液中各激素含量Fig.1 Levels of different hormones at different time points after cessation of allergenin

2.2 精準定時輸精程序對后備母豬早期胚胎發育的影響

從表1可以看出，試驗組和對照組后備金烏母豬頭均排卵分別為17.5枚和15.25枚，差異不顯著(P>0.05)；屠宰輸卵管回收到的受精卵中單細胞、2-4-8細胞胚所占比率也未見顯著差異(P>0.05)；體外培養發育的囊胚率差異也不顯著(P>0.05)。胚胎形態結構無明顯差異(圖2)。這說明定時輸精程序對后備母豬排卵數和早期胚胎發育無不良影響。

2.3 精準定時輸精對試驗金烏豬繁殖性能的影響

由表2可知，后備金烏母豬定時輸精組與對照組的參與配種率分別為100%、90%，參繁分娩率分別為86.66%、85.00%，均無顯著差異(P>0.05)。窩均總產仔數分別為10.69頭、9.64頭，窩均活仔數分別為10.46頭、9.41頭，組間差異不顯著(P>0.05)；但與自然發情組相比，精準定時輸精組母豬窩均總產仔數、窩均活仔數均提高約1.05頭，這說明經FTAI程序處理不僅能提高后備母豬利用率，而且能提升窩均總產仔數與窩均活仔數。

2.4 精準定時輸精對大長后備母豬主要繁殖性能的影響

表3顯示，參繁大長后備母豬定時輸精組的參配率和分娩率分別為100%與93.61%，比對照自然發情組后備豬的參配率(93.68%)、分娩率(89.47%)高，組間差異不顯著(P>0.05)；定時輸精組后備豬窩均活仔數11.1頭，比對照組增加了0.58頭，組間差異也不顯著(P>0.05)；另外，定時輸精組的斷奶仔豬成活率高達91.91%，比對照組斷奶成活率88.92%提高了2.99百分點，組間差異不顯著(P>0.05)。說明精準定時輸精不僅可提高后備母豬的利用率、增加窩均活仔數，也有利于提高仔豬斷奶成活率。

表1 精準定時輸精程序處理對后備母豬早期胚胎發育的影響

A、B、C：試驗組胚胎，從左到右依次為2細胞期、4細胞期、囊胚期；D、E、F：對照組胚胎，從左到右依次為：2細胞期、4細胞期、囊胚期。標尺=100 μm。A，B，C: The embryo of FTAI group: 2 cell stage，4 cell stage and blastula stage; D，E，F: The embryo of control group: 2 cell stage，4 cell stage and blastula stage. Bar=100 μm.圖2 胚胎早期發育情況Fig.2 Early embryonic development

表2 精準定時輸精程序處理對金烏豬繁殖性能的影響

表3 精準定時輸精程序對大長母豬繁殖性能的影響

3 結論與討論

3.1 定時輸精程序處理對后備母豬生殖激素的影響

母豬的正常發情周期啟動是在促性腺激素釋放激素、促卵泡素、促黃體素、雌激素、孕酮和催乳素(prolactin，PRL)等激素的共同調節作用下完成[4]。正常母豬的發情周期有黃體期和卵泡期。后備母豬定時輸精是模擬正常發情周期各相關激素水平的互作機制，利用特定的外源激素人為干預達到在預設時間段內集中發情、排卵與配種。其中，飼喂外源激素烯丙孕素可維持生理周期的黃體期，維持體內相對高位的孕酮水平，抑制腺垂體FSH的快速分泌，避免卵泡的增長排卵；一旦體內孕酮水平下降就會刺激雌激素水平增加，促進腺垂體FSH與LH的分泌增加，促進卵泡的增大與發育，在這個過程中給予外源激素PMSG則有兼具FSH與LH的綜合作用，能短期內輔助加速卵泡的發育；而一旦體內FSH水平達到一定峰值，則需要通過使用具有LH活性的促性腺激素如hcG或通過使用GnRH類似物來誘導排卵。本研究采用的是ALT+PMSG+GnRH式FTAI，血樣采集時間為ALT停喂0、42、122 h，結果顯示，從定時輸精操作程序中外源藥物的停喂(0 h)至肌注PMSG(42 h)，血漿P4值呈逐漸降低趨勢；血漿E2值從80.0 pmol·L-1降至58.3 pmol·L-1，這主要是烯丙孕素的停喂解除了對腺垂體分泌FSH與LH的抑制，促進卵巢卵泡生長；在肌注PMSG(42 h)至肌注GnRH(122 h)，血漿E2值又上升至134.07 pmol·L-1，變化趨勢與Guthrie等[5]的研究結果相一致。0～122 h，血漿FSH值呈上升趨勢，而血漿LH值呈先上升后下降趨勢，與Guthrie等[6]的研究結果類似。Guthrie等[6]認為，卵泡成熟過程中，隨著E2增加，FSH存在減少的可能性，作者還證實卵泡排卵前黃體生成素含量升高發生的時間在停喂烯丙孕素后的5～6 d(122 h左右)。本試驗結果證明，FTAI程序中外源激素的給予時間點能模擬豬正常生理周期激素變化，起到協同發情排卵的作用。

3.2 定時輸精程序處理對后備母豬早期胚胎發育的影響

本試驗結果顯示，定時輸精試驗組豬卵巢排卵數比對照組增加，但差異不顯著，囊胚發育率與自然發情豬無顯著差異，說明定時輸精程序不影響受精胚胎質量，這一結論與Degenstein等[7]的研究結果一致，其試驗中采用烯丙孕素飼喂17 d+PMSG+hcG方式，hcG處理后50～55 h屠宰，測定的排卵后形成的紅體有顯著差異，卵巢殘留的白體無顯著差異，并且其研究表明胚胎數的增加與后備母豬窩均總產仔數、窩均活仔數的提高有直接關系。胚胎數的增加是因為定時輸精程序中PMSG具有FSH和LH的聯合作用，與自然發情內源性激素的規律性相比，能增加排出的卵泡數。Ravagnani等[8]研究表明，在18 d內使用ALT進行母豬發情同步，排卵率、胚胎數量、受精卵無顯著差異，但增加了妊娠第28天的腺管面積、周長和子宮內膜總面積，因此為胚胎著床與妊娠提供了良好環境，也為最終母豬的窩均總產仔數、窩均活仔數的提高奠定了生理基礎。

3.3 定時輸精程序處理對后備母豬繁殖性能的影響

FTAI程序處理的后備母豬100%可以參繁生產，有效降低了后備母豬的淘汰率，而且操作簡單、執行力強、效率高。本研究采用的是ALT+PMSG+GnRH式FTAI，2個不同品種后備豬試驗結果均表明，參繁配種率、分娩率、窩均總產仔數、窩均活仔數均比對照組要高，這與Wang等[9]和Lopes等[10]的結果一致。這主要與FTAI程序中飼喂烯丙孕素一定時間后卵巢狀態改善有一定關系，在協同使用PMSG下可獲得更多的卵泡發育與同步排卵，從而提高受精率和窩產仔數。吳寶云等[11]比較了精準定時程序ALT+PMSG+GnRH與簡式烯丙孕素式效果，結果表明，ALT+PMSG+GnRH式FTAI程序的窩均總產仔數、窩均活仔數比簡式烯丙孕素式高。另外，本試驗結果顯示，后備母豬采用FTAI程序除了增加窩均總產仔數、窩均活仔數外，斷奶成活率與自然發情豬相比提高了2.99百分點，這可能與FTAI生產的后代往往是批次式單元全進全出有一定關系，是否存在普遍性有待進一步研究。

綜上，本研究中ALT+PMSG+GnRH式精準定時輸精程序激素用藥處理符合母豬生理發情周期特質，可增加排卵數，不影響早期胚胎發育，可提高后備母豬的利用率，增加窩均總產仔數、窩均活仔數，而且能提高仔豬斷奶成活率，可由此實現規模豬場的生產批次化。