基于重組截短蛋白mp-tGAPDH的微小支原體抗體間接ELISA檢測方法建立和應用

付 媛，石團員，孫洪超

(浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

嗜血支原體(Hemotropicmycoplasma，HM)，又稱附紅細胞體，是一類感染多種哺乳動物，寄生于紅細胞表面及骨髓中的支原體[1]。HM破壞紅細胞導致宿主發生溶血性、傳染性貧血，可導致母豬流產死胎、仔豬貧血、黃疸和消瘦[2-3]。我國豬群中流行三種HM，早期鑒定的豬支原體(Mycoplasmasuis，M.suis豬附紅細胞體)、2011年分子生物學水平鑒別的微小支原體(M.parvum)和2017年報道的新種CandidateMycoplasmahemosuis(CMh)[4-6]。

PCR方法病原流行病學調查發現M.parvum在我國浙江和海南有較高的流行率，兩種或三種豬源HM混合感染多有發生，母豬感染率較高[6-7]，目前僅有M.suis血清抗體檢測方法的報道[8-9]，缺少M.parvum和CMh的抗體檢測方法。甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH)是糖酵解途徑中重要的酶類和看家基因，同時具有參與細胞內消化、tRNA轉運、DNA修復和復制、細胞凋亡等多種生物學功能[10]。研究表明，M.suis的GAPDH(以前稱作MSG1)也同樣有重要的生理功能，作為和紅細胞膜黏附相關的黏附因子對于豬附紅體的生物化學反應和生理功能有重要的意義，也是致病相關因子，同時該蛋白具有良好的免疫原性，可用于血清學診斷[11]。我們已克隆到M.parvumZJ9330株GAPDH基因序列mp-gapA[12]。在前期研究的基礎上，本研究擬建立M.parvum血清抗體 ELISA方法，用于檢測豬群M.parvum抗體水平和流行病學監測，為該病的控制提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和血清

大腸埃希菌Transetta(DE3)感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司，由248份血液采自浙江省紹興上虞、杭州蕭山等6個豬場，實驗室分離血清-20 ℃保存備用。M.parvum51份陰性血清為進口種豬血清，由浙江省出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心惠贈，經PCR檢測病原陰性。M.parvum陽性血清為PCR方法鑒定陽性母豬采集血清，小鼠抗mp-tGAPDH血清由本試驗室制備保存。M.parvumDNA模板、pET28載體、M.suis和CMh陽性血清、豬弓形蟲病(Toxoplasmagondii，TG)的陽性血清均由本試驗室保存。豬圓環病毒病(porcine circovirus，PCV)、豬瘟(classical swine fever virus，CSFV)、偽狂犬病(pseudorabies virus，PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)陽性血清均來自IDEXX 公司相應的ELISA檢測試劑盒。

1.1.2 主要試劑和儀器

過氧化物酶標山羊抗豬IgG購自KPL公司；親和層析Ni-NTA Argrose Beads為Invitrogen公司產品，TMB和其他試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司；酶標儀為美國Molecular Devices公司Spectra Max M5；蛋白電泳儀為Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

根據已克隆M.parvum浙江9330株的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因gapA序列信息(序列號KU246052)[12]，比對已知的3種豬源HMgapA基因序列分析，選擇差異較大且抗原性好的區域設計引物，序列為mpgnf：5′-ccatggGCAGAAATTTATTAGA-3′;mpgnr：5′-ctcgagAACAATTAAATTATGG-3′，上游引物含有NcoⅠ(ccatgg)酶切位點和保護性堿基，下游引物含有XhoⅠ(ctcgag)酶切位點，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，預期擴增404 bp片段。擴增截短蛋白mp-tGAPDH DNA序列，構建pET28-mp-tGAPDH質粒，在大腸埃希菌Transetta(DE3)優化表達mp-tGAPDH，通過Ni Argrose純化蛋白，用小鼠抗mp-tGAPDH血清Western-blot檢測其抗原性。

1.2.2 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定

采用方陣滴定的方法，將起始濃度為560 μg·mL-1mp-tGAPDH純化蛋白用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液倍比稀釋包被酶標板，每孔100 μL，每個濃度包被1行，37 ℃溫育1 h后，4 ℃過夜，取出用PBST洗滌液洗滌3次，每次3 min，每孔加入200 μL 5%脫脂乳封閉液，37 ℃封閉1 h，PBST洗滌；陽性血清和陰性血清分別在酶標板的前6列及后6列進行橫向倍比稀釋，每個稀釋度縱向做8孔重復，每孔100 μL，37 ℃反應1 h后，PBST洗滌；加入1∶10 000羊抗豬IgG-HRP(用封閉液稀釋)，每孔100 μL，37 ℃反應30 min；洗滌后加入TMB底物100 μL，室溫反應5 min；最后加入50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4終止反應，用酶標儀在450 nm波長下測定D值，以陽性血清作用孔D450值開始出現較大變化，而對應的陰性血清孔D450值基本不變所對應的抗原濃度及血清稀釋倍數作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數。

1.2.3 最佳封閉液和封閉時間選擇

分別以最適mp-tGAPDH抗原濃度37 ℃1 h，4 ℃過夜包被酶標板，洗滌3次后，用質量百分數為2.5%、5.0%、7.5%的脫脂奶粉，1%、2%、3%BSA等6種不同的封閉液進行封閉，每孔150 μL于37 ℃封閉0.5、1.0和1.5 h。分別按照間接ELISA檢測程序操作，測定D450，計算各組陰、陽性血清的P/N值，選擇合適的封閉液和封閉時間。

1.2.4 血清最佳反應時間

按照最佳條件依次包被、封閉和加入血清，37 ℃下反應0.5、1.0和1.5 h，重復2孔。后進行ELISA檢測，測定D450，計算各組陰、陽性血清的P/N值，以選擇合適的血清最佳反應時間。

1.2.5 酶標二抗工作濃度和時間的確定

按照最佳條件依次包被、封閉和加入血清作用后，經洗滌加入酶標二抗(1∶7 500、1∶10 000、1∶12 500稀釋)，每孔100 μL，重復2孔，37 ℃下反應30、45、60 min，進行ELISA檢測，測定D450，計算各組陰、陽性血清的P/N值，以選擇適宜酶標二抗工作濃度和時間。

1.2.6 間接ELISA陽性臨界值的確定

1.2.7 特異性試驗

用建立優化好的mp-tGAPDH間接ELISA方法分別檢測幾種常見豬病PCV、CSFV、PRV、PRRS、TG的陽性血清，酶標儀讀取D450值，以此確定ELISA方法檢測血清的特異性。

1.2.8 重復性試驗

1.2.9 ELISA檢測豬源嗜血支原體抗體應用

用mp-tGAPDH ELISA方法對浙江上虞地區5個不同豬場的248份送檢血清進行抗體檢測，分別統計M.parvum陰、陽性血清份數。

2 結果與分析

2.1 抗原表達

PCR擴增mp-tGAPDH DNA序列連接pET28a載體，將重組質粒進行測序鑒定為404 bp，與預期相符，編碼134個氨基酸(圖1)。將構建好的pET28-mp-tGAPDH表達的截短蛋白轉化大腸埃希菌Transetta(DE3)后，IPTG誘導重組蛋白的表達，經SDS-PAGE電泳可以觀察到，mp-tGAPDH在大腸埃希菌Transetta(DE3)中大量表達，相對分子質量約為15 ku，與預期相符(圖2)。Western-blot表明，純化蛋白mp-tGAPDH與小鼠抗mp-tGAPDH血清有較好的反應性(圖3)。

2.2 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定

mp-tGAPDH重組蛋白方陣滴定試驗結果表明，純化抗原在1∶10～1∶160稀釋度時與陽性血清反應的D450值變化較小，而在1∶160～1∶1 280稀釋度時與陽性血清反應的D450值大幅度下降，因此選定D450值開始出現大幅度降低時的抗原稀釋倍數1∶160(560/160，3.5 μg·mL-1)包被。抗原在1∶160稀釋時，1∶160稀釋的陽性血清與陰性血清的比值(P/N)最大，此時陽性血清D450值接近于1，陰性血清的D450值基本不變，因此，選擇1∶160為血清最佳稀釋倍數。

M，DNA marker DL1000；1、2，M. parvum陽性血液PCR擴增mp-tGAPDH 基因片段；3、4，陰性對照；M, DNA marker DL1000; 1, 2, PCR product of mp-tGAPDH from M. parvum positive blood sample; 3, 4, Negative control.圖1 mp-tGAPDH基因PCR擴增Fig.1 Amplified mp-tGAPDH gene fragment by PCR

M，Protein marker；Lane 1, 2，pET28-mp-tGAPDH在大腸埃希菌Transetta(DE3)表達目的片段的SDS-PAGE電泳；3，pET28a 在大腸埃希菌Transetta(DE3)表達目的片段的SDS-PAGE分析。M, Protein marker; Lane 1, 2, pET28-mp-tGAPDH in Transetta(DE3); 3, pET28a in Transetta(DE3).圖2 mp-tGAPDH在大腸埃希菌中的表達分析Fig.2 SDS PAGE analysis expression of mp-tGAPDH in different E. coli

M，Protein marker；1，純化mp-tGAPDH的SDS-PAGE電泳分析；2，小鼠抗mp-tGAPDH 血清和mp-tGAPDH純化蛋白的Western-blot反應，箭頭指示反應條帶。M, Protein marker; 1, SDS-PAGE of purified mp-tGAPDH; 2, mp-tGAPDH Western-blot using mouse anti-mp-tGAPDH serum. Reaction band indicated by arrow.圖3 重組蛋白mp-tGAPDH Western-blot分析免疫反應性Fig.3 Western-blot analysis immunoreactivity of mp-tGAPDH

2.3 最佳封閉液和封閉時間選擇

將包被好的ELISA 酶標板條分別以 2.5%、5.0%、7.5%脫脂乳，1%，2%、3%BSA進行封閉，隨機選取的6份M.parvum陽性血清(P)和6份陰性血清(N)用ELISA方法測定D450值之比(P/N)。從P/N值可以看出，7.5%脫脂奶粉最佳，其次為5.0%脫脂奶粉，而BSA作為封閉液陰性本底高，不適宜封閉(表1)。

將包被好的ELISA 酶標板條分別選用5.0%和7.5%脫脂奶粉封閉0.5、1.0、1.5h后，隨機選取的6份M.parvum陰、陽性血清所測定的D450值之比(P/N)如表2所示，mp-tGAPDH抗原以5%脫脂奶粉封閉1.5 h結果最理想。

表1 mp-tGAPDH ELISA最佳封閉液優化結果

表2 mp-tGAPDH ELISA封閉液封閉時間優化結果

2.4 血清最佳反應時間

在確定的重組抗原最佳包被濃度、血清最佳稀釋倍數、最佳封閉液濃度、最佳封閉時間的條件下，隨機選取的6份M.parvum陰、陽性血清作用時間設置3個梯度，所測定的D450值之比。血清作用0.5、1.0、1.5 h后，從測定血清的P/N值看，mp-tGAPDH重組抗原ELISA方法待檢血清作用1.0 h效果最佳(表3)。

2.5 酶標二抗工作濃度和時間的確定

采用優化好的其他ELISA條件，選用1∶7 500、1∶10 000、1∶12 500稀釋的二抗作用30 min后，測定隨機選取的6份M.parvum陽(P)、陰(N)性血清D450比值(P/N)。測定的結果表明，mp-tGAPDH抗原包被的板以二抗1∶12 500稀釋濃度作用最佳(表4)。

采用優化好的其他ELISA條件，選用1∶12 500稀釋的二抗作用30、45、60 min后，測定隨機選取的6份M.parvum陽、陰性血清的D450P/N值。測定的結果以60 min作用時間最佳(表5)。

2.6 優化后的ELISA反應條件

表3 mp-tGAPDH ELISA血清作用時間優化結果

表4 mp-tGAPDH ELISA二抗稀釋倍數優化結果

表5 mp-tGAPDH ELISA二抗作用時間優化結果

經優化mp-tGAPDH間接ELISA操作步驟如下：mp-tGAPDH抗原按3.5 μg·mL-1(1∶160)稀釋包被，每孔100 μL，于37 ℃溫育1 h后放置于4 ℃過夜；取出用洗滌液洗滌3次，每次3 min，然后每孔加入150 μL 5%脫脂乳，37 ℃封閉1.5 h，洗滌1次；然后將待檢血清1∶160稀釋后加入酶標板，每孔100 μL，于37 ℃反應1 h；洗滌3次后，加入1∶12 500羊抗豬IgG-HRP(用封閉液稀釋)，每孔100 μL，37 ℃反應1 h；經洗滌后加入TMB底物100 μL，室溫反應5 min，最后加入50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4終止反應，用酶標儀在450 nm波長下測定D值。

2.7 間接ELISA陽性臨界值的確定

2.8 特異性試驗

用建立的mp-tGAPDH ELISA方法分別檢測PCV、CSFV、PRV、PRRS、TG的標準陽性血清，檢測結果見表6。mp-tGAPDH間接ELISA與檢測的豬病血清無交叉反應，mp-tGAPDH ELISA可以檢出CMh陽性血清，不能檢出M.suis陽性血清。

表6 mp-tGAPDH 間接ELISA方法的特異性

2.9 重復性試驗

2.9.1 批內重復

2.9.2 批間重復

2.10 ELISA檢測豬源嗜血支原體抗體應用

用建立的重組抗原ELISA方法對浙江省上虞地區5個豬場248份臨床送檢血清進行了檢測，結果表明M.parvum血清陽性率為36.69% (91/248)，疑似31份。

表7 mp-tGAPDH間接ELISA同批抗原包被板批內變異系數

表8 mp-tGAPDH間接ELISA不同批抗原包被板批間變異系數

3 討論

嗜血支原體不能體外培養，相關研究進展緩慢，Hoelzle等[11]證實M.suis首個黏附蛋白MSG1具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)活性，該蛋白可利用宿主血糖，使宿主血糖濃度急劇下降，重組表達MSG1定位于大腸埃希菌細胞表面，且與豬紅細胞膜相互作用，粘附于紅細胞表面。同時該重組蛋白作為疫苗候選分子可以引起豬群明顯的體液和細胞免疫反應[9]，但攻毒保護試驗沒有效果，用該重組蛋白建立的ELISA方法有較好的特異性，比菌體抗原ELISA更為敏感和有效[13]。這些研究表明，GAPDH蛋白在豬源嗜血支原體中具有研究價值和意義。

分析三種豬源嗜血支原體GAPDH氨基酸序列發現在20～155 aa區域差異較大，該區域具有良好的抗原性[12]，所以本研究選擇表達該段區域截短GAPDH蛋白，為建立ELISA方法提供診斷抗原，并嘗試鑒別豬源HMs抗體，但由于GAPDH為看家基因，其保守性不容忽視，建立的ELISA檢測方法不能有效的鑒別診斷豬源嗜血支原體抗體。

ELISA方法具有靈敏、快速、簡便和易于標準化等優點，本研究首次建立了基于GAPDH截短蛋白mp-tGAPDH的M.parvum抗體檢測ELISA方法，與檢測的部分豬病血清無交叉反應，具有良好的特異性和重復性，該法為M.parvum臨床診斷、流行病學研究和免疫檢測提供有效的手段。