豬丹毒絲菌CbpB基因的克隆表達及其間接ELISA抗體檢測方法的建立與應用

劉君雯，王 迪，朱艷艷，邢 剛，占松鶴，劉曉露，魏建忠，孫 裴，劉雪蘭，李 郁，*

(1.安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036；2.馬鞍山史記動物健康管理有限公司，安徽 馬鞍山 238251；3.安徽省動物疫病預防與控制中心，安徽 合肥 230091)

豬丹毒(swine erysipelas)是由豬丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae，ER)引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病，我國農業農村部將其列為二類動物疫病。臨床表現主要為急性敗血癥、亞急性皮膚疹塊、慢性非化膿性關節炎和疣狀心內膜炎[1]。該病遍布世界各地，不僅能對豬肉生產的各個階段產生影響，而且可對密切接觸染疫動物及其產品的人員造成感染高風險。

疫苗接種是預防和控制豬丹毒的有力措施。近十多年來，由于許多豬場著重對豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒病、豬瘟、豬偽狂犬病等疫病的免疫防控，卻忽略甚或放棄了豬丹毒疫苗的正常使用，引致“老病新發”，經濟損失日趨明顯。而豬丹毒發病率和病死率的變化取決于豬群免疫狀態水平的不同，其中體液免疫起著非常顯著的作用。因此，加強ER免疫抗體與感染抗體的監測有助于ER疫苗免疫效果的評估及ER感染的調查與診斷。目前檢測ER抗體的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法主要有Dot-PAA-ELISA[2]、基于ER全菌體為包被抗原的間接ELISA方法[3]、基于ER SpaA蛋白為抗原的間接ELISA方法[4]。Dot-PAA-ELISA需要對抗體滴度進行半定量分析，操作復雜；基于ER全菌體為包被抗原的間接ELISA雖然操作過程簡單，但存在特異性差、抗原成分復雜的可能。因此，建立一種快速、敏感、操作簡便的特異性檢測豬丹毒絲菌抗體的方法尤為重要。

ER表面存在的膽堿結合蛋白(choline-binding protein，CBPs)由CbpA、CbpB、CbpC三部分組成。Shi等[5]構建的CBPs缺失突變株免疫小鼠后，可使其完全抵抗ER強毒株的攻擊，表明CBPs也是ER致病力的關鍵因素。研究發現，CbpA蛋白因單堿基缺失引起的移碼突變導致蛋白截短，CbpC蛋白被證明無免疫保護作用，而CpbB蛋白被證明是ER的表面保護性蛋白，具有良好的免疫原性，可誘導機體(小鼠、豬) IgG抗體水平升高，并對小鼠的免疫保護率達80.00%，從而免受ER強毒株的攻擊[6-7]。CbpB基因大小為1 855 bp，它所編碼的CpbB蛋白由606個氨基酸組成，主要包括N端的一段信號序列(the signal sequence)和C端的膽堿結合區域(choline-binding domain)。本實驗利用CbpB蛋白作為包被抗原建立檢測ER抗體的間接ELISA方法，旨在為豬群的ER免疫監測和流行病學調查提供可靠的技術手段。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體和血清

ER血清型1a型(代號AEr21)，E.coliDH5α、E.coilBL21菌株，載體pGEx-6P-1，ER陰性血清和陽性血清[8]，豬鏈球菌(SS)、大腸埃希菌(E.coli)、副豬嗜血桿菌(HPS)、傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)陽性血清，均由安徽農業大學動物傳染病實驗室保存提供。用于臨床檢測應用的豬血清樣品(進行和未進行ER疫苗免疫)均采自安徽地區部分豬場。

1.2 主要試劑和培養基

限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4 DNA ligase、10×loading buffer、DNA Marker 2000、DNA Marker 10000購自TaKaRa有限公司。2×Taqplus PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自天根生物有限公司。谷胱甘肽GST瓊脂糖凝膠FF購自北京瑞達恒輝科技發展有限公司。胎牛血清、Tween-20、牛血清白蛋白(BSA)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)、未預染和預染標準蛋白Marker、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液、H2SO4終止液、β-巰基乙醇和二氨基聯苯胺(DAB)購自上海生工生物工程技術服務有限公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris 堿)購自天根生化科技有限公司。脫脂奶粉、羊抗豬IgG(IgG-HRP)購自 SIGMA 公司。酶標板購自美國Corning公司、商品化ER抗體檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(ML096852)。全菌體包被間接ELISA、SpaA蛋白包被間接ELISA[4]均由安徽農業大學動物傳染病實驗室提供。含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)、含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)、LB肉湯購自紹興天恒生物科技有限公司。商品化豬丹毒滅活疫苗購自成都天邦生物制品有限公司。

1.3 目的蛋白的表達與鑒定

1.3.1 引物的合成

根據GenBank中已登錄的ER的CbpB基因(登錄號：AP012027)，應用Primer Premier5.0設計一對特異性引物，預期擴增片段為1 398 bp，上、下游引物中各引入了BamHⅠ(GGATCC)、XhoⅠ(CTCGAG)限制性內切酶的酶切位點，引物由金斯瑞生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-CGCGGATCCATGCGATTGAGACGCTTACAGAGG-3 ′；下游引物：5′-CCGCTCGAGGCCATCATTCCTGACGGT-3 ′。

1.3.2 目的片段的擴增及重組質粒的構建

采用煮沸法提取AEr21基因組DNA作為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系：PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，滅菌雙蒸水12.5 μL，DNA模板5 μL。反應條件：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 5 min，退火65 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min，35個循環；終延伸72 ℃ 10 min。反應結束后，將PCR產物進行1.00%瓊脂糖凝膠電泳，再用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的片段進行回收。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切 pGEX-6P-1和CbpB基因，進行瓊脂糖凝膠電泳后回收，用T4 DNA連接酶將兩者于16 ℃連接過夜，并將連接產物轉化入感受態細胞E.coilDH5α，涂布于Amp濃度為100 μg·mL-1的LB平板上。PCR鑒定陽性的質粒進一步作序列測定。測序由金斯瑞生物技術有限公司進行。

1.3.3 重組CbpB蛋白的表達及純化

將陽性重組質粒pGEX-6P-1-CbpB轉化至E.coilBL21感受態細胞，挑取單菌落接種于LB固體培養基(含0.10% Amp)中，37 ℃培養12 h。挑取單個菌落接種至5 mL LB液體培養基(含0.10% Amp)中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養至菌液D600為0.4，再吸取1 mL菌液轉接于100 mL的LB液體培養基(含0.10% Amp)中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養6 h，加入IPTG后繼續在30 ℃、180 r·min-1誘導表達6 h，離心收集菌體。菌體經超聲破碎后，將離心收集的上清與谷胱甘肽GST瓊脂糖凝膠FF在室溫條件下振蕩1 h，再用20 mmol·L-1谷胱甘肽溶液洗脫得到純化目的蛋白[9]。用核酸蛋白儀測定純化后的重組蛋白含量，并進行SDS-PAGE分析。

1.3.4 重組CbpB蛋白的Western-blot分析

將純化后的重組CbpB蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，于含5%脫脂奶粉的封閉液中4 ℃封閉過夜。以ER陽性血清(1∶100稀釋)為一抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后用1∶2 000稀釋的羊抗豬IgG-HRP為酶標二抗，37 ℃孵育1 h，最后置于DAB緩沖液中顯色。

1.4 CbpB蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立

1.4.1 間接ELISA主要操作步驟

將純化重組CbpB蛋白適當稀釋后加入酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜，棄去包被液，用PBST(含有0.05% Tween-20的PBS)洗滌3次，每次振蕩3 min；加入封閉液(1%BSA)，每孔200 μL，37 ℃封閉1 h，PBST洗滌3次；加入1:100稀釋的血清，每孔100 μL，并設置陰性對照，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次；加入1∶1 000稀釋的羊抗豬IgG-HRP，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次；加入TMB顯色液，每孔100 μL，37 ℃避光顯色10 min；加入H2SO4終止反應，每孔100 μL，測定D450值。每個稀釋度做3個重復，取其平均值，計算各條件下P/N值。選擇陽性血清D450值接近1.0，陰性血清D450≤0.2且P/N值最大孔所對應的優化條件為最佳[10]。

1.4.2 最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采用方陣滴定法確定最適抗原包被濃度和血清稀釋度。將CbpB蛋白用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液分別稀釋至4.0、2.0、1.0、0.5 μg·mL-1，ER陰性血清和陽性血清用PBST緩沖液均按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍稀釋后進行ELISA方陣試驗。每個稀釋度3個重復，測定D450值，計算P/N值。

1.4.3 最適抗原包被條件的確定

以最適的抗原濃度包被酶標板，分別在4 ℃過夜12 h、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜12 h、37 ℃ 2 h+4 ℃過夜12 h、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h包被后進行間接 ELISA測定。重復3次操作，讀取D450值，計算P/N值。

1.4.4 最適封閉液種類的確定

分別以1%明膠、2%脫脂奶粉、1% BSA、2% BSA、5%胎牛血清為封閉液，37 ℃封閉2 h后進行間接ELISA抗體檢測。重復3次操作，測定D450值取平均值，計算 P/N值。

1.4.5 最適血清作用時間的確定

加入血清后，于37 ℃分別作用 30、60、90 min后進行間接 ELISA測定。重復3次操作，讀取D450值并取平均值，計算P/N值。

1.4.6 最適酶標二抗濃度及作用時間的確定

按照上述確定好的最適條件依次進行包被、封閉、加入ER陰性血清和陽性血清，將羊抗豬IgG-HRP分別做1∶800、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000稀釋，于37 ℃孵育30、45、60、75 min，按照間接 ELISA方法測定。重復3次操作，測定D450值取平均值，計算P/N值。

1.4.7 最適顯色時間的確定

按照上述確定好的最適條件進行間接ELISA試驗，加入TMB后分別于37 ℃避光顯色5、10、15 min，重復3次操作，讀取D450值取平均值，計算P/N值。

1.4.8 臨界值的確定

按照上述以最適反應條件建立的間接ELISA方法，對30份已知ER抗體陰性血清進行檢測，測定其D450值，計算平均值x和標準差s，以D450

1.4.9 特異性試驗

采用建立的間接ELISA方法檢測HPS、SS、APP、E.coli、PRV、CSFV、PCV2、PRRSV及ER陽性血清各2份，同時設立ER陰、陽性血清作對照，評估該方法的特異性。

1.4.10 敏感性試驗

將ER陽性血清按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400進行倍比稀釋，采用建立的間接ELISA方法與商品化ELISA檢測試劑盒進行ER抗體滴度的檢測比較，評估該方法的敏感性。

1.4.11 重復性試驗

分別用同一批次和3個不同批次ER重組表達純化的CbpB蛋白進行包被，用建立的間接ELISA方法分別對4份ER抗體水平不同的血清樣品進行批內及批間重復性試驗，每份血清樣品重復3次檢測。計算4份血清樣品同一批內和不同批次D450值的變異系數(CV=SD/x×100%)，評估該方法的重復性[12]。

1.4.12 比對試驗

利用建立的間接ELISA方法(代號為CbpB-ELISA)檢測60份進行ER疫苗免疫的豬血清樣品，并與全菌體包被間接ELISA(代號為全菌體-ELISA)、SpaA蛋白包被間接ELISA(代號為SpaA-ELISA)、商品化抗體檢測ELISA試劑盒及Western-blot(抗原為ER重組CbpB蛋白)作平行比較，計算符合率。符合率=(陽性結果相同樣本數+陰性結果相同樣本數)/總樣本數。

1.4.13 臨床豬血清檢測

利用建立的間接ELISA方法對安徽10個地市未經ER疫苗接種的200份豬血清樣品進行感染抗體檢測。采用SPSS 22.0 軟件進行數據處理、卡方檢驗。P<0.01表示差異極顯著；P<0.05表示差異顯著；P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 CbpB基因的擴增

利用特異性引物對AEr21的CbpB基因進行PCR擴增，擴增出大小約為1 398 bp的基因片段，其長度與預期大小一致(圖1)。

2.2 重組表達質粒pGEX-6P-1-CbpB的鑒定

將陽性重組質粒雙酶切后可見相對分子質量約1 398 bp的目的條帶和4 984 bp的質粒條帶(圖2)，片段大小和預期一致。

2.3 重組CbpB蛋白的誘導表達及純化

M，DNA marker；1-2，BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切重組質粒pGEX-6P-1-CbpB。M，DNA marker; 1-2，Digested pGEX-6P-1-CbpB.圖2 重組質粒pGEX-6P-1-CbpB的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion identification of recombinant plasmid pGEX-6P-1-CbpB

用終濃度為0.6 mmol·L-1的IPTG在37 ℃誘導6 h，蛋白表達量最大，在73 ku處出現目的蛋白條帶(圖3)，與預期相同，純化后的重組蛋白含量為0.46 mg·mL-1(圖4)。

M，蛋白marker；1-2，未純化的CbpB蛋白。M，Protein marker; 1-2，Unpurified CbpB protein.圖3 CbpB重組蛋白的誘導表達Fig.3 induced expression of recombinant CbpB protein

M，蛋白marker；1-2，純化后的CbpB蛋白。M，Protein marker; 1-2，Purified CbpB protein.圖4 CbpB重組蛋白的純化分析Fig.4 Induced expression of recombinant CbpB protein

2.4 重組CbpB蛋白的Western-blot分析

對純化后的CbpB重組蛋白進行Western-blot 分析，在73 ku處出現預期的特異性條帶，而非誘導后的裂解產物則無特異性條帶，表明表達產物能夠與ER陽性血清發生特異性結合，具有良好的反應原性(圖5)。

2.5 CbpB蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立

2.5.1 間接ELISA反應條件的優化

通過最適抗原包被濃度、溫度和時間，最適血清稀釋度和作用時間，最適封閉液和封閉時間，最適酶標二抗濃度和作用時間，以及最適顯色時間等一系列試驗，優化了間接ELISA的反應條件，具體如下：包被抗原濃度為1.0 μg·mL-1，4 ℃過夜；5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h；血清稀釋度為1∶100，37 ℃孵育60 min；酶標二抗稀釋度為1∶1 000，37 ℃作用45 min；顯色時間為37 ℃作用10 min。

M，蛋白marker；1，誘導后的裂解產物；2，非誘導后的裂解產物。M，Protein marker; 1，Induced pyrolysis products; 2，Non-induced pyrolysis products.圖5 CbpB重組蛋白的Western-blot鑒定Fig.5 Western-blot identification of CbpB recombinant protein

2.5.2 臨界值的確定

2.5.3 特異性試驗

利用建立的CbpB-ELISA檢測ER陽性血清的結果為陽性，而對HPS、SS、APP、E.coli、PRV、CSFV、PCV2、PRRSV陽性血清，結果均為陰性(表1)，表明該方法具有良好的特異性。

2.5.4 敏感性試驗

建立的CbpB-ELISA與商品化ELISA試劑盒能檢測到的最高陽性血清稀釋度均為1∶12 800，表明兩種方法均具有良好的敏感性。

2.5.5 重復性試驗

建立的CbpB-ELISA批內重復性試驗的變異系數為4.08%～5.90%，批間重復性試驗的變異系數為3.59%～7.92%，均小于10%(表2)，表明該方法具有良好的重復性。

2.5.6 比對試驗

利用建立的CbpB-ELISA檢測60份經豬丹毒滅活疫苗免疫的豬血清樣品，其中52份為ER陽性血清，免疫抗體陽性率為86.67%[8]，平行比對，與全菌體-ELISA、SpaA-ELISA、商品化抗體檢測ELISA試劑盒及Western-blot的總符合率分別為91.67%、93.33%、86.67%和90.00%，其中陽性符合率分別為92.45%、94.55%、88.89%、90.91%，陰性符合率分別為85.71%、80.00%、66.67%、80.00%(表3)，表明具有較高的一致性。

表1 特異性試驗結果

表2 重復性試驗結果

表3 CbpB-ELISA與全菌體-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA試劑盒、Western-blot鑒定結果比較

2.5.7 臨床豬血清檢測

利用建立的CbpB-ELISA檢測200份未經ER疫苗免疫的豬血清樣品，其中61份為ER陽性血清，感染抗體陽性率為30.5%。樣品來源的安徽10個地市ER感染率由高到低依次是：合肥55%、阜陽40%、淮南40%、蚌埠35%、六安35%、安慶30%、亳州20%、池州20%、蕪湖20%、馬鞍山10%。卡方檢驗結果顯示：合肥與阜陽、淮南、蚌埠、六安、安慶、亳州、池州、蕪湖、馬鞍山9個地市之間ER感染率差異顯著(P<0.05)；安慶與蚌埠、六安2個地市之間ER感染率差異不顯著(P>0.05)，而與合肥、阜陽、淮南、亳州、池州、蕪湖、馬鞍山7個地市之間ER感染率差異顯著(P<0.05)；亳州、池州、蕪湖3個地市與合肥、阜陽、淮南、蚌埠、六安、安慶、馬鞍山7個地市之間ER感染率差異顯著(P<0.05)；馬鞍山與合肥、阜陽、淮南、蚌埠、六安、安慶、亳州、池州、蕪湖9個地市之間ER感染率差異顯著(P<0.05)。表明安徽10個地市均存在不同程度的ER感染，其中合肥感染率最高(表4)。

表4 安徽10個地市ER感染抗體的檢測結果

3 討論

由豬丹毒絲菌(ER)引起的豬丹毒呈全球性分布，不僅為一種人畜共患病，更是世界各國經濟上的一種重要疾病。20世紀80年代和90年代初，豬丹毒與豬瘟、豬肺疫并稱為我國養豬業的三大傳染病。隨著養豬業規模化的發展、飼養環境和管理模式的改善、疫苗和抗生素的使用，豬丹毒似乎逐漸淡出了人們的視野，致使很多養豬場忽略了對該病的防控，造成了較大的經濟損失。疫苗接種是預防豬丹毒發生的廣泛而有效的方法。當前使用的疫苗是以1型或2型的ER為基礎而制備的，既有用于肌肉注射的滅活疫苗(多為血清2型)，又有通過飲水途徑的減毒活疫苗(多為血清1a型)。迄今為止ER共有26個血清型(1a、1b、2～24型和N型)，豬丹毒自然病例主要是由血清1a、1b或2型引起，我國豬群中流行的血清型主要為1a型(80%～90%)，其次是2型[13-14]。不同ER菌株的毒力存在明顯的差異，這是由一些毒力因子調控所致。ER最重要的毒力因子是神經氨酸酶、莢膜多糖和表面蛋白，其中表面蛋白如SpaA、CbpB等與ER的致病力密切相關[5]。CbpB蛋白C端的膽堿結合區域能夠與絕大多數革蘭氏陽性細菌的細胞表面結合，在其感染過程中起著很重要的作用，而CbpB蛋白主要免疫保護功能的核心片段多位于N端[6-7]。作為ER莢膜修飾蛋白，CbpB不僅介導增強ER對宿主細胞的黏附作用、減弱吞噬細胞對病原菌的吞噬作用，而且經CbpB蛋白免疫的小鼠血清則具有促進體外巨噬細胞的吞噬作用[5，15]。

目前，國內外均未見基于CbpB蛋白建立檢測ER抗體的間接ELISA方法的相關報道。本實驗克隆表達了ER(血清1a型)的表面蛋白CbpB，通過親和層析法純化蛋白，通過Western-blot鑒定重組表達蛋白具有良好的反應原性。利用重組表達純化的CbpB蛋白作為包被抗原，通過對抗原包被濃度、血清稀釋度、酶標二抗稀釋度及反應時間等一系列條件的優化，建立了檢測ER抗體的間接ELISA方法(CbpB-ELISA)。該方法與其他諸如HPS、SS、APP、E.coli、PRV、CSFV、PCV2、PRRSV陽性血清均不出現特異性結合反應，僅可檢測ER抗體，當ER陽性血清稀釋至1∶12 800時仍可檢出，批內及批間變異系數均小于10.00%，與全菌體-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA試劑盒和Western-blot的總符合率分別為91.67%、93.33%、86.67%和90.00%，其中陽性符合率分別為92.45%、94.55%、88.89%、90.91%，陰性符合率分別為85.71%、80.00%、66.67%、80.00%，表明本實驗所建立的CbpB-ELISA具有良好的特異性、敏感性、重復性以及可靠性。

在成功建立CbpB-ELISA用于檢測ER抗體的基礎上，進一步利用該方法對來自安徽10個地市的臨床樣品進行檢測。在200份未經ER疫苗接種的豬血清樣品中，61份為陽性，檢出率為30.50%，表明安徽各地市均有不同程度的ER感染現象，不同地市之間的感染情況差異顯著，其中合肥的感染率最高，其次是阜陽和淮南。Holt等[16]和Shimoji等[17]分別對老撾和日本未經ER疫苗免疫的家豬和野豬進行血清學調查，結果顯示，老撾和日本ER感染抗體陽性檢出率分別為45.20%(293/647)和95.60%(1312/1372)。2009年周緒斌等[18]對我國33個豬場共775份血清樣品進行ER感染抗體檢測，陽性率為14.19% (110/775) 。雖然我國豬群中ER感染的整體比例不甚高，但本實驗的結果顯示，安徽豬群中ER感染率高于全國平均水平，故應引起高度重視，加強對豬丹毒的預防和控制。

4 結論

本實驗以重組表達的CbpB蛋白作為包被抗原，成功建立了具有良好的特異性、敏感性、重復性和可靠性的檢測ER抗體的間接ELISA方法。應用建立的方法對進行和未進行ER疫苗免疫的豬血清樣品進行抗體檢測，確證了該方法可用于臨床ER的免疫監測和流行病學調查。