中國被毛孢三種菌絲形態的超顯微特征觀察

謝 放，夏櫻霞，蘇強軍，UWITUGABIYE Vestine，陳照禾，周 剛

(蘭州交通大學 化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070)

中國被毛孢被大多數學者認為是冬蟲夏草菌的無性型[1-3]。在實驗室條件下培養時經常在典型的基內菌絲表面或邊緣長出密集的鈕狀菌絲團和氣生菌絲。通過觀察實驗室人工培養的中國被毛孢長出原基的現象發現，基內菌絲表面出現的菌絲團生長一定時間后可轉變為針頭狀原基，但當氣生菌絲出現后該生物學過程不再發生。目前，三種菌絲的超顯微特征和產生機制未見報道。由于以往研究的中國被毛孢菌種大多是由冬蟲夏草經組織分離而獲得的[4]，形態差異明顯的氣生菌絲究竟是雜菌或其他因素的影響無法確證。經組織分離獲得的菌株材料，通過挑取單菌絲方法進行純化的難度大，要排除雜菌因素，必須是單孢分離方法獲得的純化菌種才可以進行研究。本研究采用光斑標記法[5]分離純化得到單孢菌株，以保證菌種的可靠性，從而排除雜菌可能的干擾。

在常見的食用菌栽培中，子實體發生的菌絲變化已經研究清楚，菌絲需經過扭結、針頭狀鈕結、菌蕾等過程才可形成子實體[6]。而中國被毛孢形成子實體的過程還沒有明確，培養過程中出現的菌絲團扭結是否都會發育成針頭狀原基、菌蕾等結構仍有待研究[7]。本實驗通過對單孢純化方法獲得的中國被毛孢菌株生長發育過程中的3種形態菌絲進行掃描電鏡觀察，掌握不同菌絲的形態特征，了解其整個生長發育過程，排除雜菌干擾的可能，為今后人工培養過程中促進菌絲分化出原基進而形成子實體提供指導，同時對更深入研究菌絲發育機理和調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草單孢菌株的采集與分離

2019年5月從甘肅天祝藏族自治縣帶土采集完整的新鮮冬蟲夏草，于實驗室16～18℃中培養，使其進一步發育成熟并彈射子囊孢子。當子實體上的子囊殼表面出現白色纖維狀孢子時，將滅菌玻璃紙袋套于子實體以收集子囊孢子，每3 d更換1次玻璃紙袋。用無菌水沖洗玻璃紙袋收集子囊孢子到試管中，稀釋至每毫升大約100個，吸取200 μL的孢子懸液置于1%水瓊脂固體培養基中并均勻涂布后于18 ℃黑暗培養，每2 d觀察一次孢子萌發情況。利用光斑實時標記法[5]分離萌發的單孢子轉接到牛奶培養基上，置于16 ℃下黑暗培養。

1.2 培養基

本研究采用1%水瓊脂培養基(瓊脂10 g，加入蒸餾水定容至1000 mL，pH自然)和牛奶培養基(馬鈴薯200 g，牛奶200 mL，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.2 g，酵母粉1 g，水解乳蛋白5 g，復合維生素B1一片，瓊脂15 g，加入蒸餾水定容至1000 mL，pH自然)，配置的培養基經121℃高壓滅菌后備用。

1.3 中國被毛孢三種菌絲的形態觀察

每7 d觀察1次牛奶培養基上的單孢菌落生長情況，參照文獻[8-9]從宏觀上對菌落生長速度、菌落顏色、色素分泌、菌絲質地等方面進行形態鑒定并拍照記錄。微觀上使用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡對菌絲粗細、彎曲度、膨大部分、菌絲間關系、菌絲表面特征等方面進行觀察分析并拍照記錄。

1.4 三種菌絲形態的掃描電鏡觀察

本研究采用掃描電子顯微鏡觀察菌株TZ8-1的3種常見菌絲形態。分別挑取氣生菌絲、菌絲團、基內菌絲于2.5%戊二醛中4℃固定12 h；0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min；各體積分數梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、95%)脫水1次后用100%乙醇脫水2次，每次20 min；用乙醇和乙酸異戊酯混合液(體積比1∶1)處理30 min；最后用乙酸異戊酯處理2 h后置于冷凍干燥機中處理15 h；干燥后的菌塊固定于樣品臺上進行噴金處理，置于掃描電鏡下觀察、測量3種形態菌絲的形狀和大小并拍照。

2 結果與分析

2.1 三種菌絲的宏觀形態特征

本研究發現，菌株TZ8-1在牛奶培養基上生長緩慢。培養60 d時表現為革質狀的基內菌絲(圖1-A)，呈蚯蚓糞狀，質地堅韌，多隆起褶皺，呈現棕黃色，且整個菌落會從中間部位隆起并蔓延，菌落背部凹陷，有少量褐色色素分泌至培養基。培養120 d時，在基內菌絲表面形成若干致密且表面粗糙的絨狀白色菌絲團(圖1-B)。同一條件下繼續培養180 d時白色疏松的氣生菌絲(圖1-C)開始增多，并逐漸延伸至整個菌落表面。

2.2 三種菌絲的光學顯微鏡觀察

由圖2可以看到，中國被毛孢三種不同形態的菌絲存在顯著差異。基內菌絲(圖2-A)的典型特征為：菌絲隔膜不明顯，菌絲較粗，排列緊密，分支多，彎曲度高，菌絲之間多以相互纏繞的方式分布。

菌絲團(圖2-B)的典型特征為：菌絲隔膜不明顯，隔膜間距和菌絲粗細不均勻，分支多、彎曲度高，菌絲之間交錯、重疊現象明顯，菌絲雜亂生長，排列無規律性。說明菌絲有扭結的趨勢，但外觀沒有呈現明顯的針頭狀，說明原基的分化還受其他因素的調節或刺激。

氣生菌絲(圖2-C)的典型特征為：菌絲平直、隔膜明顯，菌絲粗細均勻，排列疏松，分支少，次級菌絲多且以并列方式分布，彎曲度低，菌絲之間相互融合、交錯、重疊現象不明顯，生長較為整齊，具有方向性。同時在菌絲頂端或中部以出芽的方式形成大量的分生孢子(圖2-C中箭頭1、2所指部分)，多數呈腎形，少數以橢圓形、長橢圓形及近球形等形態存在，形成后掉落或附著在菌絲上，說明氣生菌絲是中國被毛孢無性孢子繁殖的主要狀態。這一現象暗示著在培養后期，隨著營養和水分的消耗，氣生菌絲為了爭奪營養空間加速生長，進而產生了大量的分生孢子。

綜上，3種菌絲的顯微形態差異較大。基內菌絲粗且多分支，彎曲度高，排列緊密且相互纏繞。構成菌絲團的菌絲粗細不一，多分支，排列無規律。氣生菌絲粗細均勻，少分支且彎曲度低，排列疏松。

2.3 三種菌絲的掃描電鏡觀察

本研究對3種菌絲的掃描電鏡(圖3)觀察可以確定菌絲的粗細、彎曲度、膨大部分、菌絲間關系、菌絲表面特征等微觀特征。對3種形態菌絲的特征描述如表1所示。

A，基內菌絲；B，菌絲團；C，氣生菌絲。標尺為5 μm。A，Substrate mycelium；B，Hyphae kont；C，Aerial mycelium. Bar=5 μm.圖2 中國被毛孢TZ8-1三種菌絲的光學顯微圖Fig.2 Optical micrographs of three kind of mycelium of Ophiocordyceps sinensis TZ8-1

圖3-A顯示基內菌絲排列緊密，圖3-B中箭頭所指為基內菌絲的“H”型融合，與毛雄明等[10]的觀察結果一致。圖3-C中箭頭所指為部分基內菌絲發生重疊。基內菌絲發生菌絲的“H”型融合和重疊，且菌絲較粗、多分枝，這種生長方式增強了菌絲對環境的適應能力，達到吸收更多營養物質的目的，有利于菌絲網絡的形成[11]，為中國被毛孢進一步的生長發育奠定基礎。

表1 中國被毛孢TZ8-1三種菌絲的掃描電鏡特征

A—C，基內菌絲；D—F，菌絲團；G—I，氣生菌絲。標尺：A，D，G為20 μm；B，E，H為10 μm；C，F，I為 5 μm。A-C，Substrate mycelium；D-F，Hypha knot；G-I，Aerial mycelium. Bar: A，D，G=20 μm；B，E，H=10 μm；C，F，I=5 μm.圖3 中國被毛孢TZ8-1三種菌絲的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy of three kind of mycelium of Ophiocordyceps sinensis TZ8-1

圖3-E中箭頭所指部分為菌絲的膨大部分，此現象發生在基內菌絲完成營養生長后出現的菌絲團中，圖3-F中箭頭所指為菌絲的扭結部分，在其他食用菌相關研究中，刺芹側耳在給予光照刺激后菌絲發生扭結，形成原基，進而分化成菇蕾[12]。金針菇菌絲體受到機械損傷后通過上調表達疏水蛋白來誘導菌絲的扭結進而形成子實體[13]。

圖3-I中1所指為氣生菌絲表面所附著的分生孢子，其數量多、分布廣。這表明在營養匱乏的后期為爭奪營養空間，氣生菌絲不斷延伸并產生大量的分生孢子加速繁殖。圖3-I中2為菌絲發生的褶皺部分，猜測其原因是樣品制備過程中脫水或干燥環節操作不當造成的。

3 討論與結論

關于分生孢子的產生方式。本研究發現分生孢子在菌絲頂端或中部直接以出芽的方式形成，這不同于王燦[14]與何蘇琴等[15]的報道，中國被毛孢的分生孢子產生于已分化的分生孢子梗或具有一定形狀小梗上。但與肖巖巖等[16]的觀察結果一致，即分生孢子可通過在菌絲兩側或頂端產生芽生孢子的方式產生。與前兩者不同的原因可能是所用菌種來源于甘南藏族自治州且經組織分離獲得，而與后者相同的原因是所用菌種由單個子囊孢子分離而來。因而，菌種的產地來源、分離方法和培養方法都是造成差異的因素。此外，取樣時間也可能對分生孢子產生方式的觀察有一定的影響，其具體原因有待進一步深入研究。

菌絲團中的菌絲膨大現象可能是作為一個臨時儲藏營養的場所[17]，蓄積營養為進一步發育成針頭狀原基做準備。膨大部分是否為扭結出現針頭和菌蕾的前期征兆還未可知。因取樣時間限制了后期進一步觀察菌蕾的形成，故菌絲膨大的原因有待深入研究。

三種菌絲的發生順序有時間差異，即與培養時間或營養脅迫有關，如香菇菌絲在營養消耗至不適于繼續生長時菌絲發生扭結形成菌絲團，最終發育成原基[18]。

本研究發現，菌絲團未能扭結成為針頭狀原基，推測原因是上述培養基不能滿足發育成針頭狀的營養條件，需要其他因素的協助刺激。其內在機理有待進一步探討。

綜上所述，中國被毛孢在固體培養基上出現的3種菌絲形態與菌株純度無關，是菌種的特性之一。三種菌絲的顯微形態差異明顯，氣生菌絲是中國被毛孢無性孢子繁殖的主要狀態。 且分生孢子的產生方式是芽生。