初榨橄欖油中多酚化合物的UPLC-FLD檢測及其抗氧化活性研究

李 雪，張 玉，王君虹，朱作藝，孫素玲，劉 志，4，朱申龍，沈國新，Agusti ROMERO，王 偉，*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，浙江 杭州 310021； 2.農業農村部農產品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021； 3.木本油料品質營養國際聯合實驗室，浙江 杭州310021； 4.湖南人文科技學院 農業與生物技術學院，湖南 婁底 417000； 5.西班牙加泰羅尼亞農業與食品科技研究所，西班牙 加泰羅尼亞 08140)

初榨橄欖油是以木犀科木犀屬油橄欖樹的果實為原料壓榨獲取的木本油，是健康飲食“地中海膳食”脂肪的主要來源。橄欖油營養成分復雜，其主要由98%的皂化部分及2%的非皂化部分組成，其中皂化物主要為不飽和脂肪酸，其含量約為總脂肪酸的90%，非皂化物主要為多種微量成分，包括多酚、三萜烯二醇、甾醇、角鯊烯、維生素、類胡蘿卜素及揮發性成分等[1-2]。多酚類化合物是植物主要的次生代謝物，其結構為苯環上一個或多個氫原子被羥基取代所生成的化合物，包括黃酮類、酚酸類及花色苷類等[3-4]。初榨橄欖油含有的多酚類化合物按照結構的差異可以分為酚酸類、酚醇類、酚醛類、裂環烯醚萜類、黃酮類及木酚素類等[5-6]，其中酚醇類和裂環烯醚萜類為主要成分，而裂環烯醚萜類化合物只在橄欖油中發現并報道[7]。多酚類化合物是初榨橄欖油非皂化部分的代表性營養組分，其對初榨橄欖油的色澤、風味、氧化穩定性及貨架期具有重要的影響[8]，也是初榨橄欖油抗炎、抗氧化及神經保護等多種活性的物質基礎[9-12]，其含量及種類可作為評價初榨橄欖油品質的重要指標。初榨橄欖油中的多酚化合物含量及種類受多種因素影響，其中油橄欖品種是主要因素之一[13-14]。進行不同品種初榨橄欖油中主要多酚組分含量的準確測定，是評價其營養品質的基礎，對優良品種培育、助力品牌提升具有重要意義。

多酚組分在初榨橄欖油中具有種類多、含量低的特點，因此高效分離及高靈敏度的檢測方法是對其進行分析的關鍵環節。目前，最常用的分析方法為高效液相色譜紫外檢測法[10]，該方法操作簡單、重現性好，但靈敏度低、分離時間長。隨著質譜技術的發展，色譜與質譜聯用技術廣泛用于初榨橄欖油中多酚化合物的檢測。氣相色譜-質譜法的應用可以同時定性、定量多種酚類化合物，但需要進行較為繁瑣的衍生操作[15]。超高效液相色譜聯合質譜技術的初榨橄欖油中多酚化合物檢測方法操作簡單、并具有快速、高靈敏度及高分辨率的優點，但質譜儀器成本較高，一般實驗室難以普及[16]。除此之外，有研究采用液相色譜熒光檢測法分析初榨橄欖油中的多酚化合物，結果表明，酚醇類(羥基酪醇、酪醇)及木脂素類(松脂酚)在熒光檢測法中比紫外檢測法具有更高的選擇性和靈敏度[17-19]。但目前對裂環烯醚萜類化合物橄欖苦苷和女貞苷的熒光檢測法研究極少，而基于超高效液相色譜結合熒光檢測技術的初榨橄欖油多酚化合物檢測方法報道也較少。因此，本研究以初榨橄欖油中6種主要多酚化合物為實驗對象，建立超高效液相色譜熒光檢測方法，運用該方法對不同品種初榨橄欖油多酚含量進行測定，比較不同品種間多酚組分的差異；并對初榨橄欖油多酚提取物的抗氧化活性進行測定，研究多酚化合物與抗氧化活性的相關性，為油橄欖育種及初榨橄欖油的品質評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

初榨橄欖油由澳大利亞橄欖油協會提供，5個品種作為供試材料，分別為Coratina、Picual、Arbosana、Koroneili及Arbequina。

羥基酪醇、酪醇、香草酸、橄欖苦苷、女貞苷及松脂酚標準品(純度>99%)，購自上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標準品(純度>99%)，購自阿拉丁試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司；正庚烷、無水乙醇、甲醇、福林酚試劑、碳酸鈉、冰乙酸均為國產分析純；乙腈：色譜純，德國默克公司；超純水，Millipore純水儀制備。總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(ABTS法)、羥自由基測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器設備

Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀配備TUV紫外檢測器及FLR熒光檢測器，美國Waters公司；RV10-D-V型旋轉蒸發器，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；722型紫外可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司；AMR-100全自動酶標分析儀，杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 初榨橄欖油多酚提取物制備

多酚類化合物的制備參照文獻[6]的方法，8 g初榨橄欖油樣品溶于16 mL正庚烷中，振搖，使油樣完全溶解，加入16 mL甲醇-水溶液(60∶40，V/V)，在50 mL分液漏斗中振搖2 min，靜置分層，收集下層清液；上層液體加入16 mL甲醇-水溶液(60∶40，V/V)重復操作，靜置分層，收集下層清液，合并兩次提取液后加入10 mL正庚烷進行洗滌，得到澄清下層液體。將下層液體進行低溫濃縮，80%甲醇溶液定容至25 mL，避光，放置于-20 ℃儲存，備用。

1.3.2 標準溶液的制備

稱取羥基酪醇、酪醇、橄欖苦苷、香草酸、女貞苷、松脂酚標準品各5 mg，分別用甲醇-水混合液(80∶20，V/V)溶解并定容至5 mL作為儲備液。采用梯度稀釋法用純水將儲備液配制成一系列質量濃度梯度的標準品溶液。

1.3.3 超高效液相色譜條件

Cadenza色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35℃；進樣量10 μL；流速0.8 mL· min-1；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脫梯度：0～2 min，10%～20% B；2～5 min，20%～20% B；5～7 min，20%～19% B；7～8 min，19%～25.5% B；8～11 min，25.5%～25.5% B；11～15 min，25.5%～50% B；15～17 min，50%～90% B。熒光光譜激發波長278 nm，發射波長339 nm。紫外光譜檢測波長為280 nm及340 nm。

1.3.4 方法學考察

標準曲線、定量限和檢出限。精密吸取6種多酚化合物的混合標準品，分別稀釋1.7、5、20、50、100、500、2 500、10 000倍，在1.3.3節色譜條件下進行測定，計算峰面積。以標準品質量濃度(x，μg·mL-1)為橫坐標，以峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。以信噪比為10時的質量濃度作為定量限，信噪比為3時的質量濃度作為檢出限。

精密度實驗。按照1.3.2節制備標準溶液，在1.3.3節色譜條件下連續進樣5次，并連續進樣3 d，計算6種多酚化合物峰面積的RSD。

回收率實驗。稱取精煉橄欖油樣品，加入6種標準品，按照1.3.1節方法制備多酚提取物，再按照1.3.3節色譜條件進樣，并計算6種化合物的加標回收率。

1.3.5 總多酚含量的測定

參照文獻[6]中總多酚測定方法，采用福林酚比色法于750 nm波長處測定其吸光度，并根據沒食子酸標準工作曲線計算油樣中的多酚含量。

1.3.6 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除活性測定。參照文獻[3]報道的方法，稍加改動：吸取樣品待測液2.0 mL，加入0.2 mmol·L-1DPPH溶液2.0 mL，搖勻，室溫反應30 min，以無水乙醇調零，測定517 nm波長處的吸光度；樣品待測液2.0 mL與無水乙醇2.0 mL混合，在517 nm處測定吸光度；測定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇的混合液在517 nm波長處的吸光度。計算DPPH清除率。

總抗氧化活性測定(ABTS法)。按試劑盒說明書操作，反應完成后，在405 nm波長處測定吸光度，同時以水溶性Trolox標準品質量濃度(mmol·L-1)為縱坐標，以其吸光度為橫坐標，制作標準曲線，樣品總抗氧化能力以Trolox當量計算，單位為mmol·L-1。

抑制羥自由基能力測定。按試劑盒說明書操作，反應完成后，550 nm波長處，測定樣品吸光度，以H2O2作為標準對照液，同時規定每毫升樣品在37 ℃下反應1 min時體系中H2O2濃度降低1 mmol·L-1為一個抑制羥自由基能力單位，U·mL-1。

1.4 數據處理

本研究獲得的數據采用3次重復實驗的平均值和相對標準偏差(RSD)表示。利用SPSS16.0及HemI 1.0.3.7軟件進行數據顯著性及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 多酚化合物標準品溶液和初榨橄欖油樣品的UPLC檢測

首先，本研究對紫外檢測器和熒光檢測器檢測6種多酚化合物的結果進行比較分析。由圖1-a、c可見，在此色譜條件下，6種多酚化合物的標準品可以得到較好的分離；但在不同的檢測器下，同一樣品的色譜圖有較大差異，紫外檢測器中色譜圖基線波動較大，信號響應較弱，而在熒光檢測器中色譜圖基線平穩，信號響應強，峰形對稱。初榨橄欖油多酚提取物的熒光檢測器的色譜圖(圖1-b)中檢測到5個目標峰，其保留時間與標準溶液的化合物保留時間一致，而紫外檢測器中測得4個目標化合物，但由于其信號響應較弱，導致基質干擾更強(圖1-d)。

a、c，標準品；b、d，初榨橄欖油樣品；a、c，熒光檢測器；b、d，紫外檢測器。1，羥基酪醇；2，酪醇； 3，香草酸；4，橄欖苦苷；5，女貞苷；6，松脂酚。a，c，The polyphenol standards; b，d，The sample of virgin olive oil; a，c，Fluorescence detector; b，c，UV detector. 1，Hydroxytyrosol; 2，Tyrosol; 3，Vanillic acid; 4，Oleuropein; 5，Ligstroside; 6，Pinoresinol.圖1 多酚標準品和初榨橄欖油樣品UPLC圖Fig.1 UPLC chromatograms of the 6 polyphenol standards and the samples of virgin olive oil

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線、檢出限和定量限

如表1所示，在兩種檢測器下，6種化合物的峰面積和質量濃度之間均呈良好的線性關系，但熒光檢測器測定6種化合物的線性范圍更寬、檢出限及定量限更低，其靈敏度遠遠高于紫外檢測器。

2.2.2 精密度實驗結果

將6種多酚化合物在同一天連續進樣5次的峰面積的RSD作為日內精密度，分別為0.88%、1.26%、1.43%、4.03%、4.91%、0.69%。并將其連續進樣3 d的峰面積的RSD作為日間精密度，分別為1.26%、1.28%、1.10%、4.78%、5.41%、0.81%。結果表明，儀器精密度良好。

2.2.3 回收率實驗結果

由表2可見，在低濃度水平，6種多酚化合物的加標回收率在93.42%～119.86%，RSD≤3.12%，在高濃度水平，6種化合物的加標回收率在100.30%～116.68%，RSD≤6.26%，表明實驗方法有較好的回收率，檢測結果準確可靠。

2.2.4 多酚化合物、總多酚和抗氧化活性測定結果

如表3所示，在初榨橄欖油樣品中檢測到5種多酚化合物，女貞苷未檢出。羥基酪醇和酪醇在Coratina中含量最高，在Picual及Koroneiki中的含量次之，而Arbosana和Arbequina中含量最低。不同樣品中香草酸和松脂酚的含量變化基本一致，其在Picual及Arbosana中的含量顯著高于另外3個品種(P<0.05)。另外，不同品種對總多酚含量的影響較大，5個品種的含量范圍為同時，本實驗還對5種初榨橄欖油多酚提取物的抗氧化活性進行了研究。結果表明(表3)，其對DPPH自由基清除率為7.22%～66.23%，活性最強的為Coratina、活性最弱的為Koroneiki；對ABTS陽離子自由基清除能力范圍為0.95～2.71 mmol·L-1，其中，Coratina活性最強，而Arbequina活性最弱；抑制羥自由基能力范圍為13.24～136.06 U·mL-1，Coratina的活性最強，Arbosana活性最弱。

表1 六種多酚化合物的回歸方程、線性范圍、定量限和檢測限

表2 六種多酚化合物的加標回收率(n=3)

2.2.5 相關性分析

如圖2所示，初榨橄欖油多酚提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力與總多酚含量呈極顯著正相關，相關系數為0.980。總多酚含量與DPPH自由基及抑制羥自由基能力有相關性(相關系數>0.6)，但無顯著性差異。多酚提取物對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基及抑制羥自由基能力間呈顯著正相關。羥基酪醇含量、總多酚含量與酪醇含量顯著正相關，相關系數分別為0.979和0.915；香草酸含量與松脂酚含量顯著正相關，相關系數為0.909。而其他多酚化合物含量與抗氧化能力相關程度較低，且不具有顯著性。

3 討論

本研究建立了HPLC-FLD法檢測初榨橄欖油中6種多酚化合物含量的方法，經驗證該方法精密度高、加標回收結果準確可靠，可在17 min內對6種多酚化合物進行有效分離、峰形對稱、分離度高。與廣泛應用的HPLC-UV法比較，本方法具有線性范圍廣、檢出限和定量限低的優勢，可準確檢測初榨橄欖油中微量的酚類化合物。

多酚類化合物對初榨橄欖油的品質及功能活性的決定作用已被廣泛報道。本研究表明，5種初榨橄欖油中含有多種酚類化合物。據報道，其含量很大程度上因品種的不同而產生差異[20]。目前國內外對Coratina、Picual、Arbosana、Koroneiki及Arbequina等品種的初榨橄欖油中多酚化合物的含量已有報道[3，21-22]，但由于樣品的產地、土壤、氣候、栽培管理及加工技術的差異，不同研究中初榨橄欖油的多酚化合物含量差異較大。目前關于以上5種初榨橄欖油中單體酚及總多酚含量的比較還未見報道。本研究表明，羥基酪醇、酪醇、香草酸、松脂酚等單體酚及總多酚在不同品種初榨橄欖油中的含量具有顯著差異。Coratina中的羥基酪醇、酪醇及總多酚含量顯著高于其他品種，而Arbequina中的羥基酪醇、酪醇及總多酚含量最低。

圖2 多酚化合物與抗氧化活性的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between polyphenols and antioxidant activity

氧化損傷與多種疾病的發生、發展密切相關[23]，因此多酚類化合物的抗氧化活性是評價其功效的重要指標之一。本研究采用3種抗氧化評價體系對初榨橄欖油多酚提取物的抗氧化活性進行測定，結果表明，除了Coratina在3種體系中均表現出最強活性外，其他樣品在不同反應體系中的抗氧化作用具有一定差異，這可能由于不同的抗氧化體系，抗氧化劑的抗氧化機理不同[24]。同時本研究中不同品種初榨橄欖油多酚提取物的抗氧化活性也具有顯著性差異，相關性分析表明，總多酚含量與ABTS陽離子自由基清除能力極顯著正相關。因此，酚類化合物組成對抗氧化活性具有較大影響。

4 結論

本實驗建立了一種用于測定初榨橄欖油中6種多酚化合物的超高效液相色譜熒光檢測法，與常用的液相色譜紫外檢測法相比，該方法具有準確、快速、靈敏度高的優點。并對5個品種初榨橄欖油中的6種單體酚和總多酚含量進行了分析，評價其體外抗氧化活性，同時采用SPSS軟件進行多酚化學組分與抗氧化相關性分析。結果表明，不同品種中多種單體酚、總多酚含量及抗氧化活性具有顯著差異，其中Coratina中羥基酪醇、酪醇、總多酚含量及抗氧化活性均顯著優于其他品種，相關性結果表明，總多酚對ABTS陽離子自由基的清除能力呈極顯著正相關。因此，總多酚含量是初榨橄欖油抗氧化作用的主要因素。此外，初榨橄欖油中已報道的多酚化合物種類超過30種。因此，對初榨橄欖油酚類化合物更全面、快速、高靈敏度的檢測方法還有待進一步研究。