白藜蘆醇抗切除卵巢大鼠發生骨質疏松的作用研究

游麗娟 葸慧榮 高玉海 楊芳芳 陳克明*

1.甘肅省婦幼保健院健康管理中心，甘肅 蘭州 730050 2.聯勤保障部隊第九四○醫院骨研所，甘肅 蘭州 730050

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨微結構破壞為特征的全身性骨骼疾病[1]。絕經后的婦女由于雌激素缺乏往往會發生骨丟失和骨質量下降現象從而引發骨折甚至死亡[2]，目前臨床上關于OP的治療主要采用西藥雙膦酸鹽、甲狀旁腺類等藥物，長期服用價格昂貴、副作用大，因此，急需尋找副作用小、療效好的中藥替代藥物從而降低用藥成本[3]。

白藜蘆醇是一種結構類似雌激素己烯雌酚的天然多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[4]。研究顯示，白藜蘆醇在體外與雌激素競爭性結合雌激素受體，類似植物雌激素，發揮抗OP作用[5]。據報道，白藜蘆醇可調節血脂，具有抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤等諸多生物學活性[4-5]。淫羊藿苷是中草藥淫羊藿的主要有效成分，諸多文獻證明，淫羊藿苷具有穩定的抗OP作用，目前已有開發的淫羊藿總黃酮膠囊在我國上市用于治療原發性OP[6-7]。雖然也有白藜蘆醇對去卵巢大鼠發生OP影響報道，但這些文章大多發表于幾年前，其評價手段不全面，仍缺乏綜合系統性評價。本實驗以去卵巢大鼠為OP模型，白藜蘆醇為目標研究藥物，淫羊藿苷為陽性對照藥物，利用骨密度、生物力學、血清生化指標、骨形態計量檢測等方法全面綜合探討白藜蘆醇抗OP作用，以期能為中醫藥白藜蘆醇更好地運用于臨床OP的治療提供依據。

1 主要儀器、試劑盒與藥品

LUNAR Prodigy雙能X線骨密度測量儀(GE公司，美國)，AG-IS生物力學萬能試驗機(島津公司，日本)，SP1600硬組織切片機(LEICA公司，德國)，BX51倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)；EPOCH酶標儀(伯騰儀器有限公司，美國)。骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(IDS公司，丹麥，Lot分別為：AC-12F1，SB-TR102)；白藜蘆醇(純度≥98%，寶雞辰光生物公司，中國，Lot：20140207)；淫羊藿苷(純度≥98%，寶雞辰光生物公司，中國，Lot：20170125-2)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組與處理

6月齡SPF級Wistar雌性大鼠40只，購自中國農業科學研究院下屬蘭獸研實驗動物中心(實驗動物合格證號：SCXK(甘)2014-0006-152)。大鼠造模前按隨機數字表法分為4組，每組10只，分別為假手術組(Sham)、去卵巢組(OVX)、淫羊藿苷組(I)及白藜蘆醇組(R)。除Sham組切除卵巢體積相同脂肪外，其余各組均由背部行雙側卵巢摘除術。術后及時青霉素粉末涂抹傷口并肌肉注射青霉素消炎，后連續注射青霉素3 d繼續消炎。休整1周后開始灌胃給藥。I組給藥劑量為25 mg/(kg·d)，R組給藥劑量為8.4 mg/(kg·d)，Sham組和OVX組均給予等體積蒸餾水(1 mL/200 g)，灌胃劑量依據來源于前期實驗[8]。灌胃時間為每周一至周六早上9:00～11:00，每天灌胃1次。每2周稱1次大鼠體質量，并根據體質量對灌胃劑量進行微調整。每4周檢測一次全身骨密度，待組間全身骨密度出現顯著性差異，禁食禁水24 h后處死所有大鼠并取材。

2.2 骨密度檢測

用10%水合氯醛3 mL/kg的劑量腹腔注射逐個麻醉大鼠，后放置于雙能X線骨密度儀治療床上檢測全身骨密度值；大鼠處死后，將分離的右側股骨和椎骨分別置于骨密度儀上檢測其各自離體骨密度值。

2.3 生物力學檢測

將分離的左側股骨置于AG-IS萬能試驗機上進行三點彎曲試驗，跨距16 mm，加載速度10 mm/min，計算機自動記錄最大載荷和彈性模量的值。將分離的大鼠第5腰椎骨(L5)進行壓縮實驗，實驗開始前將椎骨用2000目砂紙打磨成近似上下兩平面平行的圓柱體，打磨后的樣本垂直放于不銹鋼金屬平臺正中央，逐漸加載壓力，加載速度為2 mm/min，記錄最大載荷和彈性模量的值。

2.4 血清生化指標分析

麻醉后的大鼠剝離腹主動脈抽取血樣后在室溫下靜置30 min，然后5 000 r/min離心8 min，將上層血清分裝于100 μL小管并做好分組標記，凍存于-80 ℃待檢測。采用骨鈣素(osteocalcin，OC)、酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)ELISA試劑盒分別檢測血清OC和TRACP-5b的OD值，按說明書制作各自標準曲線并計算出各自的濃度，單位分別為ng/mL和U/L。

2.5 骨形態計量學分析

新鮮分離的左側脛骨用4%多聚甲醛固定后4周后，每組取6只軟骨組織剝離完整的脛骨，切取帶近心干骺端1.5 cm骨組織，用樹脂包埋于直徑為2 cm高度為8 cm的玻璃瓶中。待樹脂冷卻凝固后取出包埋塊置于LEICA SP1600鋸式切片機切成約50 μm的骨片，封固，砂紙打磨，然后進行品紅-苦味酸(van gilson，VG)染色，用IPP6.0軟件分析系統選擇各組圖片并導入軟件，并根據圖片分辨率選擇對應標尺，后運用測量工具中長度、面積、顏色等選取功能分析骨小梁相關參數，包括Tb.N、Tb.Th、Tb.SP和BV/TV等，并觀察骨組織形態結構。

3 實驗結果

3.1 對大鼠體質量及器官指數的影響

實驗期間大鼠正常進水進食，精神狀態良好。如圖1所示，隨時間變化大鼠體質量變化不大，組間差異無統計學意義(P>0.05)。如圖2所示，各組間大鼠的肝、脾、肺、腎的器官指數均無統計學差異。OVX組大鼠子宮系數顯著低于Sham組(P<0.05)，I組和R組子宮系數顯著高于OVX組(P<0.05)。子宮組間差異說明大鼠切除卵巢后由于雌激素缺乏，子宮發生萎縮，子宮系數降低，而I和R組均可抑制此作用的發生。

圖1 各組大鼠體質量變化曲線Fig.1 The changing curve of the body weight of rats

圖2 各組大鼠主要臟器的器官指數Fig.2 The organ index of main organs in rats注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 對大鼠骨密度的影響

如表1所示，4周全身骨密度結果顯示，各組間骨密度變化不大，差異無統計學意義(P>0.05)；8周全身骨密度結果顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠全身骨密度值顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)；與OVX組相比，I組、R組全身骨密度均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)。如表2所示，通過檢測椎骨和左側股骨骨密度，結果呈現與全身骨密度相同的趨勢(P<0.01)。R組與I組差異無統計學意義(P>0.05)，只是平均值略低于I組，這一結果表明R可預防骨密度丟失。

表1 各組大鼠全身骨密度檢測結果

表 2 各組大鼠離體骨密度檢測結果

3.3 對大鼠生物力學的影響

如表3、4所示，OVX組與Sham組相比，大鼠股骨、椎骨的最大載荷和彈性模量均顯著降低(P<0.01)；I、R組與OVX組相比，股骨、椎骨的最大載荷、彈性模量均顯著增加(P<0.01)。I與R相比，差異無統計學意義。這一結果表明去卵巢后大鼠的生物力學性能下降，而I和R組都能抑制這一下降趨勢。R組與I組差異無統計學意義(P>0.05)，平均值略低于I組，說明R也可增加去勢大鼠生物力學性能。

表 3 各組大鼠股骨三點彎曲實驗結果

表4 實驗大鼠椎骨壓縮試驗結果Table 4 The compression test results of the vertebrae

3.4 對大鼠血清生化指標的影響

如表5所示，OVX組與Sham組相比，血清中OC含量降低而TRACP-5b含量增加(P<0.01)；I、R組與OVX組相比，OC含量均顯著增加而TRACP-5b含量均顯著下降(P<0.01)。這一結果表明I、R組都可通過促進骨形成抑制骨吸收來預防切除卵巢引起的骨丟失。I和R組差異無統計學意義(P>0.05)，只是平均值略低于I組，說明R也可改變骨形成和骨吸收相關的分子機制。

表5 大鼠血清中OC、TRACP-5b含量

3.5 對大鼠骨形態計量學的影響

如圖3所示，OVX組與Sham組相比，骨小梁數量和致密性明顯降低，且骨小梁分離度明顯變寬；I組、R組與OVX組相比，骨小梁數量、網狀交聯度明顯增加，骨小梁分離度明顯減小，連續性好。I與R肉眼識別無明顯差別。這一結果表明，I、R藥物均可通過提高骨組織密度而增加骨質量。如表6所示，OVX與Sham組相比，其骨小梁數量和面積百分比明顯降低而骨小梁分離度明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；I組和R組與OVX相比，其其骨小梁數量和面積百分比明顯升高而骨小梁分離度明顯降低，差異也有統計學意義(P<0.05)。R與I相比，各指標相差不大，無統計學意義(P>0.05)。

圖3 不同干預組大鼠脛骨近心干骺端骨組織形態學比較(40×)Fig.3 Morphological comparison of proximal tibial metaphysis among different intervention groups (40×)

表6 各組大鼠脛骨近心干骺端組織計量學靜態參數比較Table 6 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

4 討論

OP作為一種老年性疾病，絕經后婦女是主要分布人群常常會因骨質量嚴重下降喪失生活自理能力甚至縮短壽命，這給國家及家庭財力、人力造成了巨大的負擔[9]。雌激素被認為是治療絕經后OP最有效的藥物。但使用雌激素后會引起一系列副作用，如乳腺癌、子宮內膜癌、心血管等疾病的發生等[10]。淫羊藿苷作為陽性對照藥物，其來源于中草藥淫羊藿，以其為主要成分開發的淫羊藿苷總黃酮膠囊早已在我國南方上市，但其原料藥物的稀缺目前仍不能在全國普及。尋找能代替雌激素的更多中草藥以此降低用藥成本及副作用無疑會給廣大OP患者帶來福音。OVX大鼠模型很好地模擬了絕經后婦女的OP模型，是OP研究的經典動物模型，目前最為常用。

根據以往經驗，卵巢摘除后的大鼠其進食量會明顯增加，本研究統一進行了飲食的控制，排除飲食對其骨密度的影響，根據體質量結果顯示，各組間體質量無顯著性差異。但卵巢摘除后，正常情況下由于雌激素缺乏造成子宮萎縮，如OVX子宮系數所示，與Sham組具有顯著差異。當藥物治療后，發揮了類雌激素的作用，其萎縮程度得到大量緩解，如I組和R組所示，與OVX相比，其差異有統計學意義。

本實驗中OVX組8周后全身及離體骨密度、生物力學性能均顯著低于假手術組。這表明卵巢摘除后機體不能產生雌激素從而導致其骨質量和骨強度明顯下降，骨流失嚴重。血清生化指標檢測發現其骨形成降低而骨吸收增加，進一步從分子水平進行了佐證。骨形態計量學的觀察和靜態參數的測量分析，確證了OP模型的成立。

骨密度是骨質量檢測的黃金指標，通過骨密度檢測可以直觀判定骨質量的好壞[11]。骨密度結果顯示，藥物灌胃8周后I組和R組其全身骨密度、離體股骨和椎骨骨密度也有顯著增加，說明I和R均可以預防因卵巢切除而引起的骨丟失作用。I組作為陽性對照平均值略微高于R組，但幾乎無區別，說明R也能預防OP模型大鼠的骨密度的丟失，從而增加骨質量。骨的微結構和幾何形態決定骨的力學性能，不受大小和形狀的影響，它反映了骨的韌性和強度[12]。骨生物力學結果顯示，R組股骨和椎骨最大載荷均顯著高于OVX組，也再一次驗證了此藥物對增加OVX大鼠骨強度的顯著影響。血清生化指標反映的是骨代謝的本質，是骨形成和骨吸收的直觀反映，能客觀地評價骨轉換率[13]。血清骨代謝生化指標較模型組而言，骨形成因子骨鈣素活性水平顯著提高，骨吸收因子抗酒石酸酸性磷酸酶活性水平顯著下降，表明R可通過增加OVX大鼠骨骨形成的活性且抑制破骨細胞的活性從而抑制了骨質的流失。骨形態計量學是評價骨組織微結構的重要指標，反映機體組織形態學的變化情況。本實驗通過品紅-苦味酸染色客觀反映了各組間骨組織形態學的變化。結果顯示，OVX組由于卵巢切除，其骨小梁數量和致密度較Sham組顯著降低，而藥物治療后的R組骨小梁數量明顯增加，網狀結構致密，說明藥物對其骨量有顯著增加的影響。通過骨形態計量學靜態參數的分析比較，R組大鼠較OVX組在Tb.N、Tb.SP以及BV/TV數值上均有明顯增加的結果，再次驗證了R可通過改善骨組織、增加骨密度從而提高骨質量。數據中Tb.Th只是平均值有增加，但統計結果無意義，也有增加的趨勢。可能是因為其用藥時間并未達到較為理想的效果。各項指標I組和R組相比，均無統計學意義，說明R可作為中藥替代藥物治療骨質疏松，且其作用效果不次于公認骨質疏松治療藥物淫羊藿苷。

綜上所述，R可通過提高大鼠骨密度、改變生物力學性能，增加骨形成的同時降低骨吸收，增加骨組織致密結構來抑制切卵巢大鼠的骨量流失。但仍有諸多問題需進一步研究，比如延長R用藥是否效果更為理想還是作用效果消失？R藥物作用的具體分子機制是什么？R藥物的毒理實驗等還有待進一步研究。但該研究結果為OP治療尋找替代中藥提供了理論依據，從而為更多更好的中藥治療OP研究和臨床推廣奠定基礎。