阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的影響

朱忠華 唐麗琴 張世能

1.黃山市人民醫(yī)院藥劑科，安徽 黃山 245000 2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230000 3.黃山學(xué)院教務(wù)處，安徽 黃山 245000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以低骨量、骨微結(jié)構(gòu)退化，骨強(qiáng)度降低、骨脆性及骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種全身性骨骼疾病[1]。OP的發(fā)生是骨形成和骨吸收的骨重建進(jìn)程失衡，涉及調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞平衡失調(diào)的一系列細(xì)胞因子和信號(hào)分子的影響[2]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞礦化活性，增加骨密度和骨強(qiáng)度，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞凋亡，另外間接影響破骨細(xì)胞功能，影響骨吸收[3-4]。因此，本研究通過觀察雙膦酸鹽類聯(lián)合他汀類藥物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的影響，進(jìn)一步揭示雙膦酸鹽和他汀類藥物防治OP的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，以期為OP防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：J20190085)和辛伐他汀片(舒降之)(20 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：J20190621)均購(gòu)于美國(guó)默沙東制藥有限公司，Wnt、β-catenin、Runx-2多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)R&D公司。PCR試劑盒購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，雙能X線骨密度儀購(gòu)于美國(guó)Norland公司，骨生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀購(gòu)于日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：65只3月齡，體重(350±30) g，雌性SD大鼠，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，將大鼠予以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(溫度：20 ℃～25 ℃，濕度：60%～70%，12 h間隔正常照明)分籠飼養(yǎng)，自由飲食攝水。按數(shù)字表完全隨機(jī)化分組：對(duì)照組、模型組、A藥組(阿侖膦酸鈉組)、B藥組(辛伐他汀組)、A+B藥組(阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀組)。對(duì)照組不作任何處理，其余4組大鼠均行骨質(zhì)疏松模型。

1.2.2大鼠骨質(zhì)疏松造模與藥物處理：參考文獻(xiàn)[5]采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)方法構(gòu)造骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型。術(shù)后第3天均采用灌胃方式給藥，對(duì)照組和模型組：(同等量0.9% Nacl)，A藥組：[(福善美 0.5 mg/(kg·d)]，B藥組：[舒降之 4 mg/(kg·d)]，A+B藥組：[福善美 0.5 mg/(kg·d)，舒降之 4 mg/(kg·d)]，連續(xù)用藥8周。

1.2.3取材及標(biāo)本處理：采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血約6～8 mL，離心，3 000 r/min×15 min，收集上層血清1～2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饘觿冸x腰椎及股骨，以0.9%Nacl濕紗布包裹待BMD檢測(cè)，測(cè)定完畢后迅速轉(zhuǎn)入液氮，用于RT-PCR和Western blot檢測(cè)。另留取脛骨10%甲醛溶液固定，10% EDTA 脫鈣6周，制作石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4骨組織骨密度(BMD)測(cè)定：取出待測(cè)腰椎和股骨，采用DPX-L型雙能X線骨密度掃描儀，采用小物體掃描模式(類型：hHi-Res、精度：1%、速度：50 mm/s、寬度：5.0 cm、分辨率：1.0 mm×1.0 mm)等參數(shù)值，選定興趣區(qū)連續(xù)檢測(cè)5次，求其均值，軟件分析計(jì)算BMD值。

1.2.5骨組織骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定：將骨組織置于電子萬能生物力學(xué)萬能材料試驗(yàn)機(jī)，固定骨標(biāo)本位置，均取同一體位，保持標(biāo)本上下面水平，壓點(diǎn)處于骨中間位置的正上方，自上往下加載下壓直至骨斷裂，(跨距：24 mm，速度：2 mm/min，量程：1 000 N)，記錄儀記錄載荷-變形曲線。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)骨組織Wnt、β-catenin和Runx2的mRNA表達(dá)：取股骨組織30 mg，參照PCR試劑盒說明書逐步操作，Trizol法提取總RNA，依據(jù)Prime ScriptTM reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以獲得cDNA，PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：93 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性2 min，75 ℃退火40 s，60 ℃延伸60 s，共45循環(huán)。β-catenin為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。基因引物序列見表1。

1.2.7Western blot檢測(cè)骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表達(dá)：取出股骨組織20 mg，添加液氮研磨，添加細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，參照Western blot檢測(cè)步驟進(jìn)行操作，對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析。

1.2.8HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)：參照HE染色法逐步操作，蘇木精染色5 min，鹽酸酒精堿化10 s，伊紅染液染色1～2 min，光鏡下觀察并采集圖片。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 qRT-PCR amplification primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組骨組織BMD

模型組較對(duì)照組BMD(腰椎、股骨)均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組BMD(腰椎、股骨)均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高，見表2。

表2 各組大鼠骨組織Table 2 BMD of bone tissue in each group

2.2 各組骨組織生物力學(xué)

模型組較對(duì)照組最大載荷和最大應(yīng)力(腰椎、股骨)均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組最大載荷和最大應(yīng)力(腰椎、股骨)均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高。見表3。

表3 各組大鼠骨組織生物力學(xué)指標(biāo)比較Table 3 The biomechanical indexes of bone tissue in each group

2.3 各組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA表達(dá)

模型組較對(duì)照組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組骨組織mRNA均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高。見表4。

表4 各組大鼠骨組織Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA比較

2.4 各組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表達(dá)

模型組較對(duì)照組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組骨組織蛋白均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高。見圖1和表5。

圖1 Western blot檢測(cè)各組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表達(dá)Fig.1 Western blotting analysis of Wnt, β-catenin, and Runx2 protein expression in bone tissue of each group

表5 各組大鼠骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白比較

2.5 骨組織形態(tài)學(xué)

對(duì)照組脛骨骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，粗壯飽滿、豐富均勻致密，排列緊密規(guī)整，小梁間連接呈網(wǎng)狀，骨髓腔較小，骨髓細(xì)胞數(shù)量豐富。模型組骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)差，數(shù)量明顯減少，細(xì)薄，排列紊亂，部分出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，骨髓腔明顯變大。A藥組、B藥組和A+B藥組骨小梁結(jié)構(gòu)較前完整，數(shù)量增多，粗壯飽滿，排列尚規(guī)則，連續(xù)完整性較好，骨小梁間隙略有增大，且A+B藥組骨小梁結(jié)構(gòu)較雙膦酸鹽組和他汀組明顯改善。見圖2。

圖2 HE染色觀察脛骨骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)(×200)A：對(duì)照組；B：模型組；C：A藥組；D：B藥組；E：A+B藥組Fig.2 Observation of morphological structure of the tibia with HE staining (×200)A: Control group; B: Model group; C: Drug group A; D: Drug group; E: Drug group A+B

3 討論

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同作用影響著骨骼生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等一系列過程，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互耦聯(lián)、相互作用形成骨吸收和骨形成之間的平衡，影響骨骼持續(xù)重建過程，維持骨骼的平衡性和完整性[6]。OP由成骨細(xì)胞骨形成作用和破骨細(xì)胞骨吸收作用之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，骨形成緩慢，骨吸收增強(qiáng)，骨吸收強(qiáng)于骨形成，而引起骨重建失衡[7-8]。眾多細(xì)胞因子調(diào)控的信號(hào)通路，通過調(diào)控骨形成或骨吸收過程信號(hào)通路中的相關(guān)因子，以改善骨重建失衡狀態(tài)[9]。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過直接影響成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡，間接影響破骨細(xì)胞功能，在骨形成與骨吸收等骨重建方面起著十分重要作用，是當(dāng)前骨質(zhì)疏松性疾病的研究熱點(diǎn)。

阿侖膦酸鈉是首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)用于治療OP的第3代雙膦酸鹽類骨吸收抑制劑藥物[10]。他汀類藥物屬3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑[11]。辛伐他汀通過促進(jìn)Wnt蛋白與其受體Frz及輔助受體LRP5/6結(jié)合形成復(fù)合物，活化Fz受體，抑制胞質(zhì)β-catenin的降解，β-catenin累積并進(jìn)入細(xì)胞核與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，而激活下游相關(guān)靶基因Runx2、Osx、c-myc等因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[12-13]。以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和活化，并調(diào)節(jié)BMSC向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，維持骨重建過程，從而發(fā)揮抗OP作用[14]。

本研究結(jié)果表明阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀藥物組較模型組骨組織BMD、最大載荷和最大應(yīng)力均顯著升高；阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀藥物組較模型組骨組織Wnt、β-catenin、Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高。阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀藥物組骨小梁結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量增多，排列規(guī)則。表明阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀能具有協(xié)同通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路增加去勢(shì)大鼠的Runx2的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，能夠改善骨代謝，從而達(dá)到防治OP目的，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是兩類藥物防治OP主要作用機(jī)制。同樣，張磊等[15]研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀通過促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。梁耀中等[16]研究表明阿伐他汀通過上調(diào)Wnt/β-catenin表達(dá)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨整合。同時(shí)諸多研究[17-18]表明阿侖膦酸鈉、辛伐他汀兩藥聯(lián)合可改善骨質(zhì)疏松骨代謝生化指標(biāo)，增加骨密度，具有協(xié)同抗骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述，本研究初步認(rèn)為雙膦酸鹽和他汀類藥物可能通過調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，激活該通路相關(guān)因子的表達(dá)，增加去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度，提高骨生物力學(xué)性能，改善骨組織結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮對(duì)OP防治作用。但兩類藥物調(diào)控Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)途徑的具體詳細(xì)作用機(jī)制還有待深入研究，相信隨著Wnt/β-catenin信號(hào)途徑作用機(jī)制的逐漸闡明，也將推動(dòng)此類藥物防治OP研究進(jìn)展，為防治OP提供新思路和新方法。